張 妤，蔡翠芳，高曉霞

(1.山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西 太原 030031； 2.山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006)

小葉黑柴胡BupleurumsmithiiWolff var.parvifoliumShan et Y.Li為傘形科柴胡屬植物，生長于海拔2 700～3 700 m的山坡草地，產(chǎn)于我國山西、甘肅、寧夏等地[1]。小葉黑柴胡藥用部位為干燥的根，味苦，性微寒，具有疏散退熱、疏肝、升陽之功[2-3]，其含有20多種皂苷、30多種揮發(fā)油，以及木脂素等成分[4-7]，具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗肝損傷、抗肝纖維化等藥理活性[7-11]。小葉黑柴胡藥材作為柴胡的地方習(xí)用品，有較長的用藥歷史[2，3，7]，主要產(chǎn)自山西省寧武、五寨、神池等地[12]。小葉黑柴胡于1987 年作為地方習(xí)用中藥載入《山西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[2]，目前該標(biāo)準(zhǔn)僅對該藥材的性狀、炮制方法、性味、功能主治、用法用量作了簡單陳述，并不能對藥材質(zhì)量進(jìn)行有效控制。因此，本課題通過對收集自晉北地區(qū)的6個批次小葉黑柴胡藥材進(jìn)行性狀、顯微鑒別、薄層色譜鑒別、一般檢查項(xiàng)(水分、總灰分、酸不溶灰分)、醇溶性浸出物等項(xiàng)目的研究，旨在為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升及完善提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 MS-204s十萬分之一電子分析天平(METTLER TOLEDO)；SX2.5-10型高溫箱式電阻爐(北京科偉永興儀器有限公司)；DHG-9075A型鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)；LC-350A超聲清洗器(濟(jì)寧魯超儀器廠)；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司)；WHF-203 型三用紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；YD-1508B 型輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠)；生物顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；QE-100 g型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)(武漢市屹立工具有限公司)等儀器。

1.1.2 試藥 硅膠板GF254(銀龍牌，煙臺市化工研究所，批號：20191031)；甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)、乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)、二甲氨基苯甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)、硫酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)、二甲苯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)、乙酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)、乙酸乙酯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)；雙蒸水(自制)。柴胡皂苷a及柴胡皂苷d對照品(批號：110777-201711、110778-201711，中國食品藥品檢定研究院)。小葉黑柴胡藥材共6批次：S1，神池縣西溝，采集日期：2020-07-09；S2，岢嵐縣神塘坪，采集日期：2020-08-19；S3，五寨縣馬家坪，采集日期：2020-07-14；S4，寧武縣牛家?guī)X，采集日期：2020-07-11；S5，寧武縣寺耳溝，采集日期：2020-07-12；S6，神池縣大泉窊，采集日期：2020-07-10。經(jīng)山西藥科職業(yè)學(xué)院蔡翠芳教授鑒定為傘形科植物小葉黑柴胡BupleurumsmithiiWolff var.parvifoliumShan et Y.Li的干燥根。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 性狀鑒別 使用標(biāo)尺測量小葉黑柴胡根的大小。采用眼看、手摸、鼻聞、口嘗等性狀鑒定的方法直觀地對各批次樣品形狀、表面特征、質(zhì)地、斷面及氣味等進(jìn)行鑒別。

1.2.2 顯微鑒別 在小葉黑柴胡根的上部、中部、下部分別切取厚度約1 mm的薄片置載玻片上，滴加蒸餾水(必要時，加熱透化)，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下對各批次樣品進(jìn)行觀察、測量與拍照。

1.2.3 薄層色譜鑒別 取上述6批小葉黑柴胡根及其根莖分別粉碎，各取0.5 g，分別加甲醇20 mL，使用超聲清洗器超聲(200 W，40 kHz)10 min后，將濾液濃縮(5 mL)制成供試品溶液。另取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d對照品，加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg的對照品溶液。再取對照藥材柴胡0.5 g，同法制成對照藥材溶液。參照《中國藥典》薄層色譜法(通則0502)[13]試驗(yàn)，分別吸取5 μL供試品溶液、對照藥材溶液與對照品溶液，并點(diǎn)于硅膠G薄層板上，展開劑乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)，展開后取出。晾干噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，放置于紫外光燈(365 nm)下檢視。

1.2.4 一般檢查項(xiàng) 選取晉北6個地區(qū)收集的小葉黑柴胡原藥材樣品，粉碎過2號篩，備用，每個批次平行測定3次。水分，按照《中國藥典》(2015年版四部附錄 Ⅸ)[13]中水分測定法項(xiàng)下第二法(烘干法)進(jìn)行測定?？偦曳?，按照《中國藥典》(2015年版四部附錄 Ⅸ)[13]灰分測定法項(xiàng)下進(jìn)行測定。酸不溶性灰分，按照《中國藥典》(2015年版四部附錄 Ⅸ)[13]總灰分測定法項(xiàng)下酸不溶性灰分測定。

1.2.5 醇溶性浸出物 選取晉北6個地區(qū)收集的小葉黑柴胡原藥材，粉碎過2號篩，備用，每個批次平行測定3次。照《中國藥典》(2015年版四部附錄 Ⅸ)[13]醇溶性浸出物測定法項(xiàng)下的熱浸法(通則2201)測定，用乙醇作溶劑。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 性狀特征

通過對晉產(chǎn)6批小葉黑柴胡藥材進(jìn)行性狀鑒別觀察，其性狀鑒別特征(見圖1)：

根呈長圓錐形或圓柱形，多分枝，長度多5～10 cm，直徑0.2～0.8 cm。頂端有殘莖2～10個，部分排列在一個平面。根上部近圓形，有稀疏的不定芽，有時排成兩列，長0.2～0.4 cm。表面黑褐色或淺棕色，具突起的支根痕。質(zhì)硬而略韌，易折斷；斷面纖維性，皮部淺棕色，多有裂隙，木部黃白色，有放射狀紋理。氣微香，味微苦。

2.2 顯微鑒別

通過對6批小葉黑柴胡原藥材根上部、中部、下部橫切面進(jìn)行顯微觀察發(fā)現(xiàn)，該藥材的顯微特征為：木栓層為10～50余列扁平細(xì)胞組成；韌皮部外側(cè)油室細(xì)胞8～12個，內(nèi)含黃色油狀物。韌皮部油室較多，排列成2～6層，內(nèi)含黃色油狀物；形成層成環(huán)或不明顯。木質(zhì)部束放射狀排列，導(dǎo)管束間常見裂隙。見圖2。

注：1.木栓層；2.皮層；3.韌皮部；4.木質(zhì)部

2.3 薄層色譜鑒別

按照“1.2.3 薄層色譜鑒別”項(xiàng)下的方法對小葉黑柴胡樣品的根及其根莖分別進(jìn)行測定(見圖3)。6批小葉黑柴胡樣品的薄層色譜基本一致，各條帶無明顯差異。在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，且與對照藥材北柴胡薄層色譜存在顯著差異。此外，6批小葉黑柴胡的根莖薄層色譜基本一致，在小葉黑柴胡樣品及對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)顏色較淡。因此，本方法可有效鑒別小葉黑柴胡。

注：2、4、7、9、13、14為樣品的根；1、3、6、8、11、12為樣品的根莖；5為柴胡皂苷a；10為柴胡皂苷d；15為北柴胡對照藥材。

2.4 一般檢查項(xiàng)

水分：根據(jù)減少的重量，計(jì)算供試品中含水量(%)，6批藥材水分含量為6.46%～7.40%(見表1)，其中最高值為7.40%，最低值為6.46%，二者相差0.94%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，6批藥材水分含量的平均值為(6.99±0.39)%，變異系數(shù)為5.58%。通常認(rèn)為變異系數(shù)在100%以上為強(qiáng)變異，變異系數(shù)在10%～100%為中等變異，變異系數(shù)在0～10%為弱變異。供試藥材樣品水分含量為弱變異，因此暫定藥材水分不得超過9.0%(按平均水分含量1.3倍量計(jì)算取整)為標(biāo)準(zhǔn)。

總灰分：對6批小葉黑柴胡灰化后所得殘?jiān)M(jìn)行稱定，以其質(zhì)量為依據(jù)，計(jì)算藥材總灰分含量。6批樣品總灰分為5.22%～7.84%(見表1)，其中，最高值為7.84%，最低值為5.22%，二者相差2.62%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，6批藥材總灰分含量的平均值為(6.47±1.07)%，變異系數(shù)為16.54%。供試藥材樣品總灰分含量為中等變異，因此暫定藥材中總灰分含量不得超過9.0%(按平均總灰分含量1.4倍量計(jì)算取整)為標(biāo)準(zhǔn)。

酸不溶性灰分：對6批小葉黑柴胡酸溶后的殘?jiān)M(jìn)行稱定，以其質(zhì)量為依據(jù)，計(jì)算藥材酸不溶性灰分的含量。6批樣品酸不溶性灰分含量為1.13%～2.12%(見表1)，其中，最高值為2.12%，最低值為1.13%，二者相差0.99%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，6批藥材酸不溶性灰分含量平均值為(1.68±0.44)%，變異系數(shù)為26.19%。供試藥材樣品酸不溶性灰分含量是中等變異，因此暫定藥材中酸不溶性灰分含量不得超過2.40%(按平均酸不溶性灰分含量1.4倍量計(jì)算取整)為標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 醇溶性浸出物

依照記錄的質(zhì)量，計(jì)算對應(yīng)浸出物質(zhì)量百分比，即供試品中浸出物的含量(%)。6個樣品的醇溶性浸出物含量為22.98%～28.60%(見表1)。其中，最高值為28.60%，最低值為22.98%，二者相差5.62%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，6批藥材醇溶性浸出物含量平均值為(25.93±2.09)%，變異系數(shù)為8.06%。供試藥材樣品醇溶性浸出物含量是弱變異，因此暫定藥材中醇溶性浸出物含量不得低于18.0%(按平均浸出物含量的0.7倍量計(jì)算取整)為標(biāo)準(zhǔn)。

表1 小葉黑柴胡藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含量測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

柴胡屬植物在中國已有幾百年的藥用歷史，由于各地環(huán)境差異，導(dǎo)致品種不盡相同，人們根據(jù)歷史使用習(xí)慣自產(chǎn)自銷。因此，柴胡屬藥材來源復(fù)雜，市場銷售混亂，混淆品較多[14]。而藥材基原確定是制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的第一步，本課題中的6批次小葉黑柴胡試驗(yàn)樣品均為實(shí)地采集，且同時采集原植株標(biāo)本，保證了研究的準(zhǔn)確性。此外，2批次采于寧武縣，2批次采于神池，1 批次采于五寨，1 批次采于岢嵐，基本覆蓋山西省小葉黑柴胡的主要產(chǎn)區(qū)，樣品也具有一定的廣泛性和代表性。

利用性狀鑒定來鑒別藥材簡單、易行且迅速[15]，本課題對收集的所有小葉黑柴胡原藥材樣本進(jìn)行了鑒別觀察，并總結(jié)歸納了小葉黑柴胡原藥材性狀鑒別的特征，涵蓋了根外形、支根數(shù)量、表面色澤、殘留莖基、質(zhì)地及氣味等柴胡性狀差異特征，滿足了藥材流通領(lǐng)域基本鑒別的需求。顯微鑒定是中藥鑒定的重要手段之一，利用藥材的組織構(gòu)造、細(xì)胞形狀特征，達(dá)到鑒定藥材真?zhèn)蔚哪康腫16]，本課題建立的小葉黑柴胡的橫切面中木栓細(xì)胞、韌皮部油管、木化纖維群、大口徑導(dǎo)管等特征也可作為小葉黑柴胡生藥鑒別的重要參考，這些特征也可能與藥材品質(zhì)存在一定的聯(lián)系[17]。薄層色譜在植物藥成分的定性與定量分析中應(yīng)用非常廣泛，可快速有效判斷樣品中的成分及含量[16]。2015 版《中國藥典》規(guī)定柴胡藥材的薄層鑒別以柴胡皂苷 a、d 為指標(biāo)，然而柴胡類藥材基本都含有柴胡皂苷 a、d[18]，但薄層色譜圖能直觀表現(xiàn)出柴胡類藥材皂苷成分的異同及含量差異。圖3顯示，小葉黑柴胡的薄層色譜圖基本穩(wěn)定一致，與對照藥材柴胡的色譜區(qū)別明顯，與小葉黑柴胡根莖一致的薄層色譜也有明顯差異。因此，以柴胡皂苷 a、d 為參照，對比小葉黑柴胡皂苷的含量，可作為比較小葉黑柴胡薄層鑒別的依據(jù)之一。

水分、灰分、酸不溶性灰分及浸出物是影響小葉黑柴胡品質(zhì)的重要指標(biāo)，這些指標(biāo)對于小葉黑柴胡藥效的發(fā)揮至關(guān)重要。中藥材的含水量與其質(zhì)量關(guān)系密切，尤其是在中藥材的生產(chǎn)、加工、儲運(yùn)及使用過程中，對質(zhì)量變化起主導(dǎo)作用[19]。本課題中小葉黑柴胡藥材的水分含量在6.46%～7.40%，且變異系數(shù)較低，屬于弱變異，故建議水分標(biāo)準(zhǔn)按平均含水量的1.3倍量計(jì)算?？偦曳种杆幉慕?jīng)高溫?zé)胱苹一髿埩舻臒o機(jī)物，由藥材自身含有的無機(jī)成分及外來雜質(zhì)組成，而外來雜質(zhì)多為藥材在生長、加工與運(yùn)輸中粘帶的泥土、砂石等無機(jī)雜質(zhì)，是酸不溶性灰分的主要成分，在一定程度上會影響藥材質(zhì)量[20]。本課題中小葉黑柴胡藥材的總灰分含量為5.22%～7.84%，酸不溶性灰分含量為1.13%～2.12%，變異系數(shù)較高，屬于中等變異，故建議總灰分及酸不溶性灰分標(biāo)準(zhǔn)按平均含水量的1.4倍量計(jì)算。浸出物是評價中藥材質(zhì)量的重要功能性指標(biāo)，是復(fù)雜中藥成分的整體反映[16]，本課題中小葉黑柴胡藥材的醇溶性浸出物含量為22.98%～28.60%，變異系數(shù)較低，屬于弱變異，故建議乙醇浸出物標(biāo)準(zhǔn)按平均醇溶性浸出物含量的0.7倍量計(jì)算。

本課題采用多重指標(biāo)控制為小葉黑柴胡藥材的質(zhì)量研究提供了合理依據(jù)，由于目前對小葉黑柴胡相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的報(bào)道較少，本課題建立的性狀、顯微、薄層色譜，以及水分≤9.0%、總灰分≤9.0%、酸不溶灰分≤2.40%、醇溶性浸出物≥18.0%等標(biāo)準(zhǔn)可推薦暫定為該藥材的建議標(biāo)準(zhǔn)，既可用于評價晉產(chǎn)小葉黑柴胡藥材的質(zhì)量，也為其臨床用藥安全、可控提供了科學(xué)依據(jù)。