尹 麗，張純剛，周旖璇，張 強(qiáng)，程 嵐

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116620)

姜黃素是從姜科植物姜黃等的根莖中提取的一種天然黃色色素，也是一類(lèi)酸性多酚類(lèi)物質(zhì)和生物活性化合物[1]，其主鏈為不飽和脂族及芳香族基團(tuán)。幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)，姜黃素在許多國(guó)家(尤其是東南亞和印度)常被用作烹飪香料、傳統(tǒng)藥物和染料[2]。經(jīng)藥理研究表明，姜黃素有抗氧化、抗炎、抗凝、降脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗衰老消除自由基及抑制腫瘤生長(zhǎng)等作用[3-6]。另?yè)?jù)研究，姜黃素的安全劑量高達(dá)12 g/d，是目前化學(xué)療法的理想替代品[7]。許多研究實(shí)體癌癥的學(xué)者對(duì)姜黃素產(chǎn)生了極大興趣，然而，姜黃素分子間和分子內(nèi)氫鍵較強(qiáng)，在水介質(zhì)中溶解度和溶解速率極低[8]；不過(guò)當(dāng)姜黃素以晶體或溶液的形式存在時(shí)，極不穩(wěn)定[9]，紫外線照射能迅速分解姜黃素。此外，姜黃素在胃腸道吸收后，通過(guò)一級(jí)代謝快速分解，大大降低了血漿中姜黃素的有效濃度[10]。為了提高姜黃素的溶出度，改善其生物利用度，學(xué)者們采用了固體分散技術(shù)[11-16]。不過(guò)已報(bào)道的固體分散體雖能夠提高生物利用度，但仍存在很多不足，如姜黃素-EPO固體分散體的溶液穩(wěn)定性差，姜黃素-PVP固體分散體易吸濕而不穩(wěn)定等[17]。為了解決這些問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)選擇使用EPO與PVP作為輔料，通過(guò)熱熔擠出技術(shù)制備姜黃素固體分散體，該技術(shù)在提高姜黃素溶解度和生物利用度的同時(shí)也增加了制劑的穩(wěn)定性，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)過(guò)程報(bào)道如下。

1 材料與儀器

1.1 儀器

LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津公司)；UV1600紫外分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)；FA1004精密電子天平(天津天馬衡基儀器有限公司)；HX-C渦旋混合器(金壇區(qū)金城海瀾儀器制造廠)；TGL-16 g高速離心機(jī)；HAAKETMMiniCTW 錐形雙螺桿微量混合器(賽默飛世爾科技有限公司)；德國(guó)sartorius CP225D電子天平(深圳市朗普電子科技有限公司)；MTN-2800D氮吹儀(天津奧特賽恩斯)；電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；水浴鍋(鄭州博科儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 藥品與試劑

姜黃素原料藥(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20141029)；姜黃素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110823-201004)；尼莫地平對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100270-201403)；聚乙烯吡咯烷酮PVP(北京邁瑞達(dá)科技有限公司)；聚丙烯酸樹(shù)脂EPO(德國(guó)贏創(chuàng)德固賽有限公司)；乙腈(瑞典歐森巴克化學(xué)公司，色譜級(jí))；甲醇(瑞典歐森巴克化學(xué)公司，色譜級(jí))；冰醋酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純)；乙酸乙酯(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純)；鹽酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純)；β-葡萄糖醛酸酶(Sigma-Aldrich中國(guó))。

1.3 動(dòng)物

健康SD雄性大鼠12只，體質(zhì)量(250±20)g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 固體分散體的制備

稱取一定質(zhì)量比的EPO和PVP適量，將其溶于無(wú)水乙醇中，并攪拌至透明，蒸發(fā)除去乙醇后，放置于40 ℃真空干燥箱中干燥24 h，粉碎，過(guò)5號(hào)篩，得到粉末狀的混合輔料A，置干燥器內(nèi)備用。

稱取一定質(zhì)量比的姜黃素和混合輔料A于研缽中，混合均勻。在140 ℃、15 r/min的條件下，通過(guò)錐形雙螺旋微量混合器制備姜黃素固體分散體。

2.2 生物樣品中姜黃素的含量測(cè)定

2.2.1 姜黃素系列對(duì)照品溶液制備 精密稱取50 mg姜黃素對(duì)照品，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的姜黃素貯備液。量取姜黃素儲(chǔ)備液適量，然后用甲醇稀釋成不同的質(zhì)量濃度，分別制成濃度為20、100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的系列對(duì)照品溶液，于4 ℃條件下保存，備用[18]。

2.2.2 姜黃素系列質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 精密量取姜黃素適量貯備液，然后用甲醇稀釋成低、中、高(100、500、2 000 ng/mL)三種不同質(zhì)量濃度的姜黃素質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃條件下保存，備用。

2.2.3 內(nèi)標(biāo)溶液制備 精密稱取適量尼莫地平對(duì)照品，加入甲醇溶解定容，制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液。精密量取適量?jī)?nèi)標(biāo)貯備液，加入甲醇稀釋定容，制成終濃度為0.5 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液[19]。

2.2.4 色譜條件 色譜柱：Amethyst C18-H(4.6 mm×150 mm，5 μm)；預(yù)柱：Phenomenex C18(2.0 mm×4.0 mm，5 μm)；流動(dòng)相：5%冰醋酸水溶液-乙腈(40∶60，V/V)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量50 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：427 nm；柱溫：30 ℃。

2.2.5 血漿樣品處理 空白血漿處理：取100 μL空白血漿，置于5.0 mL EP管中，依次加入10 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，100 μL pH=5.0酸性溶液(酶活性最大)，渦旋1 min，再加入1 mL乙酸乙酯溶液，渦旋2 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液900 μL，置于1.5 mL EP管中，吹干后，加入80 μL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋1 min，12 000 r/min離心10 min后，取上清液50 μL進(jìn)樣分析。

血漿樣品處理：取100 μL血漿樣品，置于5.0 mL EP管中，加入100 μL pH=5.0酸性溶液(含1 000 μ β-葡萄糖醛酸酶)，渦旋1 min，在37 ℃的水浴鍋中孵化1 h，依次加入10 μL甲醇溶液，10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，1 mL乙酸乙酯溶液，渦旋2 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液900 μL，置于1.5 mL EP管中，吹干后，加入80 μL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋1 min，12 000 r/min離心10 min后，取上清液50 μL進(jìn)樣分析。

2.2.6 專屬性考察 取100 μL空白血漿按“2.2.5”項(xiàng)下“空白血漿處理”的方法操作，將其中加入10 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液和10 μL內(nèi)標(biāo)溶液改為加入20 μL甲醇溶液，得到血漿樣品A；取100 μL空白血漿按“2.2.5”項(xiàng)下“血漿樣品處理”的方法操作，得到血漿樣品B；取“2.5”項(xiàng)下給藥后0.5 h大鼠血漿樣品，按“2.2.5”項(xiàng)下“血漿樣品處理”的方法操作，得到血漿樣品C。將上述血漿樣品A、B、C按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，在該色譜條件下，姜黃素和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為4.013 min和6.432 min，兩者分離度良好，色譜見(jiàn)圖1。

2.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限考察 取空白血漿，按“2.2.5”項(xiàng)下“空白血漿處理”方法操作，制成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，分別為2、10、20、50、100、200、500 ng/mL，按“2.2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。以姜黃素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，姜黃素與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)(y)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸，回歸方程：y=0.017 4x-0.001 7，R2=0.998 5(r=0.999 2)，姜黃素質(zhì)量濃度在2～500 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好，定量下限為2 ng/mL。

2.2.8 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取低、中、高三種不同質(zhì)量濃度(100、500、2 000 ng/mL)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.5”項(xiàng)下“空白血漿處理”方法處理，在“2.2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。每個(gè)質(zhì)量濃度均制備6份平行樣品，連續(xù)測(cè)定3天，計(jì)算三種不同質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度、日間精密度、準(zhǔn)確度。結(jié)果如下，日內(nèi)精密度RSD分別為1.53%、1.72%、2.08%(n=6)；日間精密度RSD分別為1.30%、1.56%、1.50%(n=3)；準(zhǔn)確度分別為(101.2±1.54)%、(102.1±1.76)%、(100.1±2.09)%(n=6)，均符合要求。

2.2.9 提取回收率 取低、中、高三種不同質(zhì)量濃度(100、500、2 000 ng/mL)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.5” 項(xiàng)下“空白血漿處理”方法處理，每個(gè)濃度均制備3份平行樣品，在“2.2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記其峰面積為A。另外取100 μL空白血漿于5 mL EP管中，依次加入20 μL甲醇、100 μL pH5.0溶液、1 mL乙酸乙酯，渦旋2 min，12 000 r/min離心10 min，去上清900 μL于1.5 mL EP管中，再加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的姜黃素質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋1 min，吹干后，加入80 μL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋1 min，12 000 r/min離心10 min后，取上清液50 μL進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度均制備3份平行樣品，在“2.2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記其峰面積為B。通過(guò)兩者的比較，來(lái)計(jì)算姜黃素的提取回收率。結(jié)果如下：低、中、高三種不同質(zhì)量濃度的提取回收率分別為85.0 %、89.2%、87.3%(n=3)，內(nèi)標(biāo)的提取回收率為87.0%(n=3)。

2.2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取低、中、高三種不同質(zhì)量濃度的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液(100、500、2 000 ng/mL)，按“2.2.5”項(xiàng)下“空白血漿處理”方法處理，每個(gè)質(zhì)量濃度均制備3份平行樣品，分別考察室溫放置2 h，4 ℃放置24 h、凍融循環(huán)1次、凍融循環(huán)3次、-20 ℃放置30 d的穩(wěn)定性。結(jié)果如下：血漿樣品在上述條件下的RE均在±15%內(nèi)，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

取健康SD雄性大鼠12只[體質(zhì)量(250±20)g]，給藥前禁食12 h(水不限)，隨機(jī)分成兩組：一組為姜黃素原料藥，另一組為姜黃素制劑，采取灌胃給藥的方法，給藥量為50 mg/kg(以姜黃素原料藥計(jì))。在給藥0、0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36 h后經(jīng)眼眶取血0.5 mL，置于1.5 mL EP管中(肝素化)后，在12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。按?.2.5”項(xiàng)下“血漿樣品處理”方法處理后，在“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定不同時(shí)間血漿樣品中姜黃素的濃度，繪制藥-時(shí)曲線，采用DAS3.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2，藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖2。

表2 姜黃素原料藥、姜黃素制劑在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖2 姜黃素原料藥、姜黃素制劑在大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線

3 討論

本研究通過(guò)熱熔擠出技術(shù)制備姜黃素固體分散體，并建立HPLC法測(cè)定大鼠體內(nèi)姜黃素的濃度，采用DAS3.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，用于姜黃素在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

相比于原料藥組，制劑組的達(dá)峰時(shí)間提前，且出現(xiàn)多峰現(xiàn)象?？赡苁怯捎谥苿┙M中載體材料具有親水性，姜黃素的溶解度和溶出速度提高，當(dāng)部分劑量從胃中排空到小腸中延遲時(shí)，則出現(xiàn)多峰現(xiàn)象。還有可能與姜黃素的肝腸循環(huán)有關(guān)。閆文麗等[20]研究證實(shí)姜黃素在腸道的吸收速率隨時(shí)間出現(xiàn)明顯的周期波動(dòng)，且存在肝腸循環(huán)現(xiàn)象。本研究原料藥組多峰現(xiàn)象不明顯，可能是由于姜黃素自身的溶解度低，從胃中排空到小腸中，溶解度的增加不明顯，此現(xiàn)象需要進(jìn)一步研究。制劑組Cmax(94.5±13.5 )ng/mL較原料藥Cmax(45.8±5.6) ng/mL提高206%，表明固體分散體組峰濃度較高，吸收情況較好。制劑組的AUC0～36 h(689.9±79.5) ngh/mL較姜黃素原料藥的AUC0～36 h(389.6±63.2)ngh/mL提高177%，說(shuō)明將姜黃素制備成固體分散體時(shí)，生物利用度有所提高。其原因可能有：①姜黃素以非晶型狀態(tài)存在于固體分散體中，在溶出的過(guò)程中，溶出速率和溶出度都有較大程度的提高，進(jìn)而提高了姜黃素的生物利用度；②姜黃素中的羥基基團(tuán)可能與EPO及PVP中的羰基形成分子間的氫鍵，氫鍵的形成可使姜黃素在載體中保持非晶型狀態(tài)，并且由于載體材料的親水性，可以使姜黃素在介質(zhì)中的過(guò)飽和狀態(tài)維持較長(zhǎng)時(shí)間，進(jìn)而增加藥物的吸收[21-22]。