許 晨 孫麗君 柴市平 張文琦 姚春鳳 楊 蕾 楊靜宜

華北理工大學(xué) 河北唐山 063210；①唐山市婦幼保健院

妊娠期高血壓疾病是造成孕產(chǎn)婦和新生兒死亡率升高的主要原因[1]，嚴(yán)重威脅妊娠期女性生命。目前子癇前期(PE)的發(fā)病機(jī)制尚未明確，推測(cè)為胎盤(pán)血管化障礙導(dǎo)致腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活而引發(fā)高血壓表現(xiàn)。微小RNA(miRNA)是一種參與細(xì)胞增殖、血管生成和各種器官發(fā)育等的小分子非編碼單鏈RNA，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其可影響子癇前期發(fā)病，且可能存在眾多miRNA參與其中的代謝、免疫和相關(guān)信號(hào)通路調(diào)節(jié)[2]?，F(xiàn)已證明，通過(guò)miR-155-CYR61-VEGF途徑可以干擾滋養(yǎng)層遷移而抑制胎盤(pán)血管生成，導(dǎo)致PE發(fā)病[3]；miR-155也參與調(diào)控臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞因子的表達(dá)和血管舒張調(diào)節(jié)，抑制miR-155可改善內(nèi)皮功能障礙[4]。血管緊張素Ⅱ受體1(AGTR1)是血管緊張素受體家族成員之一，它使血管緊張素在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮作用，維持血壓及循環(huán)血量變化。有研究表明，AGTR1基因突變可能導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓及PE[5-6]。AGTR1基因是miR-155的靶基因之一，且二者可能均參與PE的病理進(jìn)展，故推測(cè) miR-155通過(guò)調(diào)控AGTR1的表達(dá)影響PE病理過(guò)程。本研究比較病情程度不同的PE患者胎盤(pán)組織中的miR-155及AGTR1表達(dá)，研究PE發(fā)病過(guò)程中的分子機(jī)制，為及早發(fā)現(xiàn)和提供治療PE拓展新方式。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年11月～2020年7月在唐山市婦幼保健院及唐山工人醫(yī)院行剖宮產(chǎn)術(shù)分娩的65例孕產(chǎn)婦，無(wú)原發(fā)病及其他妊娠合并癥。以婦產(chǎn)科學(xué)第9版為標(biāo)準(zhǔn)，分為正常孕產(chǎn)婦(對(duì)照組)29例、子癇前期組(PE組)15例、重度子癇前期組(重度PE組)21例。三組孕產(chǎn)婦體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，年齡、孕周、收縮壓及舒張壓差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論并已獲得批準(zhǔn)，患者知情并簽署同意書(shū)。

表1 各組患者臨床特征比較

1.2標(biāo)本收集 取剖宮產(chǎn)術(shù)中娩出的胎盤(pán)，脫離母體后1min內(nèi)，于母體面近臍帶處，切割數(shù)塊大小約1cm3的胎盤(pán)組織，避開(kāi)鈣化灶，用生理鹽水漂洗3次去除血液，紗布吸干后放入凍存管中保存于-80℃冰箱。全程保持無(wú)菌條件。

1.3主要試劑 兔抗人AGTR1多克隆抗體(ab124505，Abcom公司)，GAPDH抗體(ab-9482，Abcom公司)，山羊抗兔二抗(zb-2301，中杉金橋)，超純RNA提取試劑(TaKaRa Code D9108B)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa Code DRRO47A)，SYBR Green realtime PCR Master Mix(QPK-201，TOYOBO公司)，5x RNA Loading Buffer(TaKaRa Code DRR120A)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)胎盤(pán)中miR-155的表達(dá) 使用超純RNA提取試劑，對(duì)胎盤(pán)組織中的總RNA進(jìn)行充分提取并測(cè)定濃度及純度，電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)完整性；使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；SYBR Green realtime PCR Master Mix試劑盒及熒光定量 PCR儀對(duì) miRNA的cDNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，將目的基因引物和 U6內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，并于60℃～95℃進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析。miR-155上游引物序列為5'- GCCGAGTTAATGCTAATCGTG-3'，內(nèi)參基因引物U6上游引物序列為5'- CTCGCTTCGGCAGCACA-3'。通過(guò)2-△△CT相對(duì)定量公式計(jì)算各組胎盤(pán)組織中的miR-155表達(dá)量。

1.4.2Western blotting法檢測(cè)胎盤(pán)中AGTR1的表達(dá) 對(duì)各組胎盤(pán)組織中的總蛋白進(jìn)行提取，應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白量，以GAPDH為內(nèi)參，水浴使蛋白質(zhì)變性，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，用封閉液封閉；將封閉后的膜放入一抗(兔抗人AGTR1多克隆抗體，濃度1：1000；GAPDH兔抗，濃度1：1000)中4℃過(guò)夜；二抗(山羊抗兔二抗，濃度1：10000)進(jìn)行孵育，在凝膠成像分析系統(tǒng)中顯影，目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值之比為各組胎盤(pán)組織中的AGTR1蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1各組胎盤(pán)組織中miR-155表達(dá)情況 實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定的miR-155擴(kuò)增曲線(xiàn)為S型，擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解產(chǎn)物為單峰狀，說(shuō)明其為單一、特異性高且無(wú)污染的擴(kuò)增產(chǎn)物，見(jiàn)圖1。通過(guò)2-△△CT公式計(jì)算數(shù)據(jù)，對(duì)照組、PE組及重度PE組患者胎盤(pán)組織中miR-155的表達(dá)量分別為(1.18±0.12)、(1.57±0.07)、(1.98±0.10)，miR-155在PE組及重度PE組中的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=384.2，P=0.000)。見(jiàn)表2。

圖1 A.miR-155擴(kuò)增曲線(xiàn) B.U6內(nèi)參擴(kuò)增曲線(xiàn) C.miR-155溶解曲線(xiàn) D.U6內(nèi)參溶解曲線(xiàn)

表2 各組患者胎盤(pán)組織中miR-155、AGTR1蛋白表達(dá)量及相關(guān)性

2.2各組胎盤(pán)組織AGTR1蛋白表達(dá)情況 通過(guò)Western blotting法得到各組條帶，進(jìn)行灰度分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組、PE組及重度PE組AGTR1蛋白吸光度逐漸下降，其表達(dá)量分別為(0.86±0.08)、(0.57±0.04)、(0.29±0.07)，呈逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=99.4，P=0.000)；對(duì)照組與PE組間、PE組與重度PE組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即AGTR1蛋白的表達(dá)量隨著病情程度加重而下降。見(jiàn)圖2、表2。

2.3胎盤(pán)中miR-155與AGTR1表達(dá)的相關(guān)性 應(yīng)用Pearson法分析miR-155與AGTR1的相關(guān)性，得出其相關(guān)系數(shù)為r=-0.954，即二者呈負(fù)相關(guān)，miR-155表達(dá)增加時(shí)AGTR1的表達(dá)下降。見(jiàn)表2。

圖2 各組胎盤(pán)組織中

3 討論

PE是臨床常見(jiàn)的妊娠期高血壓疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未明確[7]。正常妊娠時(shí)，母胎間血液循環(huán)的建立需要胎盤(pán)通過(guò)血管生成和母體螺旋動(dòng)脈重塑達(dá)到充分血管化，這一過(guò)程需要促血管生成因子和抗血管生成因子的相互協(xié)調(diào)，若兩種因子的表達(dá)失衡則可能導(dǎo)致異常胎盤(pán)血管生成和疾病發(fā)生[8]。若子宮螺旋動(dòng)脈滋養(yǎng)細(xì)胞無(wú)法正常重鑄，胎盤(pán)灌注減少而釋放胎盤(pán)因子引起全身炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮損傷及進(jìn)一步的血管化障礙，導(dǎo)致RAAS系統(tǒng)激活，引發(fā)高血壓疾病的表現(xiàn)。因此，胎盤(pán)是造成PE疾病演變的重要原因之一[9]。

miRNA作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)產(chǎn)物參與降解基因和抑制翻譯過(guò)程，影響細(xì)胞增殖、血管生成及各種器官發(fā)育。胎盤(pán)可表達(dá)大量miRNA，主要源于19號(hào)及14號(hào)染色體[10]，在胎盤(pán)發(fā)育的不同階段存在時(shí)間或組織特異性。PE的病理過(guò)程中，不同miRNA參與代謝、轉(zhuǎn)錄、免疫、粘附和相關(guān)信號(hào)通路等的調(diào)節(jié)[11]。PE患者的細(xì)胞凋亡增強(qiáng)、異常免疫應(yīng)答和血管生成與miR-182和miR-210的過(guò)表達(dá)密切相關(guān)[12]。與心腦血管疾病相關(guān)的miR-499a-5p表達(dá)上調(diào)已在PE和胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限(IUGR)患者的胎盤(pán)中發(fā)現(xiàn)，而miR-26a-5p、miR-103a-3p和miR-145-5p的表達(dá)下調(diào)也在早發(fā)型PE和IUGR中發(fā)現(xiàn)[13]。PE胎盤(pán)中幾種過(guò)表達(dá)的miRNA，如miR-20b[14]、miR-16[15]和miR-675[16]等，通過(guò)抑制血管生成及滋養(yǎng)層的增殖和侵襲導(dǎo)致妊娠期高血壓疾病的發(fā)病。有研究表明，miR-155是影響內(nèi)皮細(xì)胞因子表達(dá)和血管舒張的重要因子，若被抑制則可改善內(nèi)皮功能障礙[17]。miR-155在PE患者的胎盤(pán)中高表達(dá)，表明其可能參與病理進(jìn)展過(guò)程。本研究結(jié)果顯示隨PE病情程度的加重miR-155在胎盤(pán)中表達(dá)水平逐漸上升。

AGTR1是血管緊張素受體家族成員之一，通過(guò)調(diào)節(jié)醛固酮的分泌作為控制血壓及循環(huán)血量的重要效應(yīng)器。AGTR1主要通過(guò)血管緊張素調(diào)控心血管系統(tǒng)，而血管緊張素Ⅱ(Ang II)可以通過(guò)誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和免疫細(xì)胞產(chǎn)生輕度炎癥反應(yīng)，在PE的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。有研究推測(cè)，AGTR1基因突變可能導(dǎo)致原發(fā)性高血壓、肺動(dòng)脈高壓及PE等的發(fā)病[18-19]。AGTR1基因是miR-155調(diào)控的靶基因之一，同時(shí)通過(guò)檢索可以發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)組織中的AGTR1基因表達(dá)顯著高于其他臟器組織。本研究通過(guò)Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AGTR1在PE患者胎盤(pán)組織中呈低表達(dá)，且表達(dá)程度隨病情程度加重而明顯下降。

綜上所述，PE組及重度PE組患者胎盤(pán)組織中的miR-155較對(duì)照組表達(dá)均升高，且重度PE組高于PE組；AGTR1蛋白的表達(dá)隨病情加重而下降，即miR-155和AGTR1為負(fù)相關(guān)。據(jù)此推測(cè)，AGTR1蛋白在維持胎盤(pán)正常功能中可能發(fā)揮重要功能，miR-155可能通過(guò)調(diào)控AGTR1的表達(dá)而影響PE發(fā)病。后續(xù)將通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)深入研究miR-155與AGTR1在細(xì)胞層次的關(guān)聯(lián)變化，明確二者在疾病進(jìn)展中的作用，使其能夠應(yīng)用于疾病的預(yù)防與早期診療，從而改善母嬰結(jié)局。