譚靜琳， 褚慶民， 李秋明

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州 510130）

風(fēng)濕性心臟?。╮heumatic heart disease，RHD）是A組溶血性鏈球菌感染所引起的自身免疫性疾病，主要累及二尖瓣，表現(xiàn)為瓣膜狹窄和關(guān)閉不全[1]。風(fēng)濕性心臟病在我國(guó)仍有較高的患病率，是導(dǎo)致慢性心力衰竭的主要心血管疾病之一[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)風(fēng)濕性心臟病的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)確切，但無(wú)法根治，需長(zhǎng)期甚至終生服用抗生素治療，其中大部分患者仍不可避免地發(fā)展至心力衰竭階段。中醫(yī)學(xué)無(wú)風(fēng)濕性心臟病病名，根據(jù)心悸、關(guān)節(jié)紅腫熱痛等主要臨床癥狀，將其歸屬于“心痹”范疇?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》提及“脈痹不已，復(fù)感于邪，內(nèi)舍于心”“心痹者，脈不通，煩則心下鼓，暴上氣而喘”。我院應(yīng)用麻黃加術(shù)湯加減治療風(fēng)濕性心臟病外感風(fēng)寒濕證的療效甚佳。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理角度發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是風(fēng)濕性心臟病的炎性滲出階段還是肉芽形成階段，均可予麻黃加術(shù)湯辨證使用[4]。但其作用機(jī)制尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（network pharmacology）是基于藥理學(xué)及生物學(xué)等多學(xué)科的交叉理論，其可運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)及網(wǎng)絡(luò)分析等多項(xiàng)前沿技術(shù)，揭示“方劑-成分-靶標(biāo)-疾病”之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從多維度理解疾病的分子基礎(chǔ)，預(yù)測(cè)藥物的藥理學(xué)潛在機(jī)制[5]，為新藥研發(fā)或老藥新用提供新的思路。因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析麻黃加術(shù)湯干預(yù)風(fēng)濕性心臟病的有效藥性成分和可能的分子通路，以期為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件來(lái)源中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)（TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php/）；通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（UniProt）（https：//www.uniprot.org/）；在線(xiàn)人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）（http：//omim.org/）；人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards）（http：//www.genecards.org/）；生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（DAVID）（https：//david.ncifcrf.gov/）；STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）；OmicShare網(wǎng)站（http：//www.omicshare.com/tools）；網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治鲕浖﨏ytoscape 3.7.0。

1.2中藥活性成分的收集與篩選在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“麻黃”“桂枝”“苦杏仁”“甘草”“白術(shù)”為關(guān)鍵詞，檢索獲取相關(guān)中藥化學(xué)成分信息，以類(lèi)藥性（drug-like，DL）≥0.18、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%為條件對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行篩選[6]，獲取活性成分。OB代表口服藥物的活性或有效成分到達(dá)體循環(huán)并被吸收的程度和速度，OB值越高代表藥物生物活性分子的DL越好[7]。

1.3藥物作用靶標(biāo)與風(fēng)濕性心臟病靶標(biāo)的獲取應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的靶標(biāo)預(yù)測(cè)功能搜集上述中藥的有效化學(xué)成分的靶標(biāo)蛋白，借助UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)導(dǎo)入蛋白名稱(chēng)并限定物種為“人”，將檢索到的所有靶標(biāo)蛋白校正為Official Gene Symbol，得到靶標(biāo)蛋白所對(duì)應(yīng)的基因名[8]。通過(guò)輸入關(guān)鍵詞“rheumatic heart disease”，在數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM與GeneCards中收集風(fēng)濕性心臟病靶標(biāo)。最后將各個(gè)藥物作用靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)作比對(duì)，篩出二者的共同靶標(biāo)，得到麻黃加術(shù)湯對(duì)風(fēng)濕性心臟病的靶標(biāo)。

1.4活性成分-風(fēng)濕性心臟病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將麻黃、桂枝、苦杏仁、甘草、白術(shù)的活性成分與風(fēng)濕性心臟病靶標(biāo)上傳到Cytoscape 3.7.0軟件中，構(gòu)建藥物活性成分-風(fēng)濕性心臟病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)表示靶標(biāo)或化合物，而邊則表示活性成分與風(fēng)濕性心臟病靶標(biāo)之間的相互作用。

1.5靶標(biāo)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索麻黃加術(shù)湯和風(fēng)濕性心臟病疾病的潛在靶標(biāo)，物種選擇為“Homo Sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)置為“Medium Confidence（中等置信度）”0.4[9]，其余參數(shù)作默認(rèn)設(shè)置處理，獲得靶標(biāo)的相互作用關(guān)系。再通過(guò)Cytoscape 3.7.0軟件制作出PPI網(wǎng)絡(luò)，使用Network Analyzer進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，根據(jù)連接度調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的大小，制作出PPI網(wǎng)絡(luò)。連接度即Degree，是指PPI網(wǎng)絡(luò)里節(jié)點(diǎn)所通過(guò)的邊的個(gè)數(shù)。Degree值越大代表此節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的關(guān)系更緊密，在網(wǎng)絡(luò)中地位越重要。

1.6 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析在數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID中導(dǎo)入麻黃加術(shù)湯和風(fēng)濕性心臟病疾病的潛在靶標(biāo)，選擇“OFFICE_GENE_SYMBOL”“Gene List”，種屬選為“Homo Sapiens”，再選取“Gene Ontology”下的“GOTERM_BP_DIRECT”以及“pathways”下的“KEGG_PATHWAY”進(jìn)行GO生物過(guò)程的富集分析以及KEGG通路分析。以P<0.01且從小到大排序作為篩選條件，選取符合條件的前20位的GO生物過(guò)程及KEGG通路。再應(yīng)用OmicShare云平臺(tái)，進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。參考現(xiàn)有研究，篩選出與風(fēng)濕性心臟病治療相關(guān)的可能通路，與藥物相應(yīng)的活性成分構(gòu)建出“藥物-靶標(biāo)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1麻黃加術(shù)湯的藥物作用靶標(biāo)預(yù)測(cè)及分析以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件，共篩選出針對(duì)風(fēng)濕性心臟病的120個(gè)活性成分，其中，麻黃22個(gè)，桂枝6個(gè)，苦杏仁16個(gè)，甘草88個(gè)，白術(shù)4個(gè)（活性成分在藥物之間有重復(fù)），見(jiàn)表1（僅列舉25個(gè)）。將該活性成分的靶標(biāo)輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)后獲得相同數(shù)目基因靶標(biāo)，將所有的基因靶標(biāo)與數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM和GeneCards中涉及風(fēng)濕性心臟病的基因進(jìn)行匹配對(duì)比，最終獲得可能與風(fēng)濕性心臟病有關(guān)的靶標(biāo)103個(gè)。

表1 麻黃加術(shù)湯針對(duì)風(fēng)濕性心臟病活性成分的基本信息Table 1 Data of active ingredients from Mahuangjiazhu Decoction for rheumatic heart disease

（續(xù)表1）

2.2麻黃加術(shù)湯活性成分-風(fēng)濕性心臟病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖1結(jié)果顯示，此網(wǎng)絡(luò)共包括228個(gè)節(jié)點(diǎn)、975個(gè)邊。節(jié)點(diǎn)分別表示麻黃加術(shù)湯潛在的活性成分與作用靶標(biāo)。而圖中麻黃加術(shù)湯中多個(gè)靶標(biāo)可對(duì)應(yīng)相同的活性成分，一個(gè)靶標(biāo)也可與不同的活性成分相對(duì)應(yīng)，可見(jiàn)麻黃加術(shù)湯治療風(fēng)濕性心臟病具有多成分、多靶標(biāo)的特點(diǎn)。圖1中，連接較多的節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐的作用，可能是核心活性成分或者關(guān)鍵靶點(diǎn)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小根據(jù)Degree值來(lái)展示，經(jīng)Network Analyzer分析，Degree值排名前5位的中藥活性成分分別是槲皮素（quercetin）、木 犀 草 素（luteolin）、山 柰 酚（kaempferol）、柚皮素（naringenin）、甘草查爾酮A（licochalcone A）。排名前5位的靶標(biāo)分別是人前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2），雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1），雄激素受體（androgen receptor，AR），一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2），過(guò)氧化物酶增生激活受體（peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARG）。

2.3靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖2結(jié)果顯示，共同靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)共包括102個(gè)節(jié)點(diǎn)（已剔除1個(gè)游離節(jié)點(diǎn)）、1 678個(gè)邊。圖中Degree值越大則節(jié)點(diǎn)顏色越深，且節(jié)點(diǎn)越接近圖中圓心。麻黃加術(shù)湯治療風(fēng)濕性心臟病的靶標(biāo)中Degree值排名前5位的靶標(biāo)為蛋白激酶Bα（protein kinase B alpha，PKBα，又稱(chēng)AKT1）、白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA），白細(xì)胞介素8（interleukin 8，IL-8，又稱(chēng)CXCL8）。

圖2 麻黃加術(shù)湯治療風(fēng)濕性心臟病共同靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Protein-protein interaction network of rheumatic heart disease treated by Mahuangjiazhu Decoction

2.4 GO生物過(guò)程和KEGG通路富集分析圖3、4結(jié)果顯示：麻黃加術(shù)湯治療風(fēng)濕性心臟病GO生物過(guò)程存在化學(xué)刺激、氧化應(yīng)激、炎癥生成等多個(gè)條目；其KEGG富集通路有白細(xì)胞介素17（IL-17）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、Toll樣受體（TLR）信號(hào)通路、輔助性T細(xì)胞17（Th17）細(xì)胞分化通路、T細(xì)胞受體（TCR）信號(hào)通路等。

圖3 活性成分對(duì)應(yīng)靶標(biāo)的GO生物過(guò)程分析Figure 3 GO biologicalprocess analysis of active ingredients-matched targets

圖4 活性成分對(duì)應(yīng)靶標(biāo)的KEGG通路富集分析Figure 4 KEGG signaling pathway enrichment analysis of active ingredient-matched target

2.5麻黃加術(shù)湯-風(fēng)濕性心臟病靶標(biāo)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖5結(jié)果顯示，麻黃加術(shù)湯治療風(fēng)濕性心臟病是一個(gè)涉及多個(gè)靶標(biāo)及通路的過(guò)程。通路主要涉及IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、TLR信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化通路、TCR信號(hào)通路。

圖5 麻黃加術(shù)湯-風(fēng)濕性心臟病靶標(biāo)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)圖Figure 5 Network of Mahuangjiazhu Decoctionrheumatic heart disease target-KEGG signaling pathway

3 討論

麻黃加術(shù)湯由麻黃、桂枝、苦杏仁、甘草、白術(shù)組成，方中：麻黃辛溫走散，祛風(fēng)以發(fā)表，功專(zhuān)開(kāi)阻除痹，其通脈鎮(zhèn)痛效果居諸藥之首。無(wú)論是經(jīng)方，還是后世之經(jīng)典方劑，凡治痹名方，其中皆有麻黃，且無(wú)問(wèn)寒熱虛實(shí)[10]。加白術(shù)以除濕而固里，又有桂枝和營(yíng)達(dá)衛(wèi)，助麻黃以發(fā)表，杏仁疏肺降氣，導(dǎo)白術(shù)以宣中；更加甘草協(xié)和表里[11]，行開(kāi)阻除痹之功。在麻黃加術(shù)湯活性成分-靶標(biāo)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)中，槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、甘草查爾酮A與風(fēng)濕性心臟病關(guān)聯(lián)性最高，且均屬黃酮類(lèi)化合物。幾乎每一種黃酮類(lèi)化合物都具有抗氧化活性，通過(guò)直接清除自由基、抑制活性氧簇（ROS）相關(guān)酶的產(chǎn)生，增加細(xì)胞分泌抗氧化介質(zhì)，保護(hù)心肌細(xì)胞[12]，通過(guò)清除自由基及降低促炎因子、上調(diào)抗炎因子，從而發(fā)揮抗炎作用[13]。其中，槲皮素在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已被證實(shí)具有較好的心肌細(xì)胞保護(hù)作用，可能與其強(qiáng)抗氧化活性相關(guān)[14]；木犀草素也同樣被證實(shí)通過(guò)降低氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)炎癥因子分泌、調(diào)控多條信號(hào)通路，從而緩解炎癥反應(yīng)，保護(hù)心臟[15]；山柰酚脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）抑制劑，抑制白三烯的產(chǎn)生、減輕炎癥反應(yīng)[16]；低濃度的柚皮素可以減少前列腺素E2的生成，降低環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）的表達(dá)，而高濃度的柚皮素則可以抑制核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的活化，從而減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生[17]；甘草查爾酮A則通過(guò)激活相關(guān)通路，抑制ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，保護(hù)心肌細(xì)胞[18]。

與藥物活性成分關(guān)聯(lián)最密切的靶標(biāo)分別是PTGS2、ESR1、AR、NOS2、PPARG。PTGS2是一種氧化應(yīng)激相關(guān)因子，與介導(dǎo)炎癥生成的前列腺素生物合成有關(guān)[19]；ESR1為雌激素受體，與心力衰竭相關(guān)[20]；而AR則為雄激素受體，研究發(fā)現(xiàn)，AR在心肌中增加，與自身免疫性心肌炎進(jìn)展的時(shí)間有關(guān)[21]；NOS2存在于免疫系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)中，在細(xì)胞受到刺激后被激活，在炎癥和細(xì)胞損傷中起重要作用[22]；PPARG參與體內(nèi)多種生理及病理過(guò)程，包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及動(dòng)脈粥樣硬化等[23]。另一方面，風(fēng)濕性心臟病PPI網(wǎng)絡(luò)中靶標(biāo)AKT1、IL-6、CXCL8、MAPK3、VEGFA高表達(dá)。AKT1能促進(jìn)氧化應(yīng)激產(chǎn)生ROS和活性氮，導(dǎo)致大量自由基形成，進(jìn)而損傷細(xì)胞[24]；IL-6與CXCL8屬于白細(xì)胞介素家族，是公認(rèn)的重要炎癥因子；MAPK3被證實(shí)與全身性炎癥患者，如膿毒癥患者的預(yù)后相關(guān)[25]；VEGFA是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族成員，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，促進(jìn)VEGFA表達(dá)可產(chǎn)生心肌保護(hù)的作用[26]。提示當(dāng)麻黃加術(shù)湯治療風(fēng)濕性心臟病時(shí)，方劑中的黃酮類(lèi)化合物與上述靶標(biāo)的調(diào)控密切相關(guān)。

經(jīng)GO與KEGG富集分析，在GO生物過(guò)程中，靶標(biāo)主要集中于化學(xué)刺激、氧化應(yīng)激、炎癥生成等作用；KEGG通路分析結(jié)果顯示，靶標(biāo)主要涉及IL-17、TNF、TLR、Th17、TCR等信號(hào)通路。研究證實(shí)：關(guān)于IL-17信號(hào)通路，IL-17是T細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)因子，IL-17與受體結(jié)合后，可通過(guò)MAPK3途徑和NF-κB途徑，促進(jìn)釋放前炎性細(xì)胞因子來(lái)放大炎癥反應(yīng)[27]；關(guān)于TNF信號(hào)通路，TNF-α抑制β-腎上腺素能受體，交感神經(jīng)激素的反饋增加，使促炎因子TNF-α升高，從而導(dǎo)致自我延續(xù)周期，而這種循環(huán)獨(dú)立于由損傷引起的促炎和抗炎反應(yīng)，激活有害的信號(hào)通路機(jī)制，引發(fā)心肌肥大和心力衰竭[28]；關(guān)于TLR信號(hào)通路，TLR通過(guò)不同的識(shí)別途徑活化多種免疫細(xì)胞，啟動(dòng)非特異性免疫應(yīng)答并激起適應(yīng)性免疫應(yīng)答以清除病原體，該通路在炎癥、免疫細(xì)胞調(diào)控、存活和增殖方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[29]；關(guān)于Th17細(xì)胞分化通路，Th17細(xì)胞是由Th0細(xì)胞在IL-6和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）的刺激，以及白細(xì)胞介素21（interleukin 21，IL-21）的促進(jìn)下分化而成的，分化后促進(jìn)中性粒細(xì)胞的動(dòng)員、募集和活化，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，因此它與自身免疫性疾病，感染性疾病以及腫瘤的發(fā)生均有密切的關(guān)系[30]；關(guān)于TCR信號(hào)通路，TCR能特異性識(shí)別抗原提呈細(xì)胞表面MHC提呈的抗原肽，通過(guò)誘導(dǎo)TCR鄰近酪氨酸激酶活化，促進(jìn)信號(hào)傳遞復(fù)合物組裝，活化下游MAPK、PKC以及鈣離子等信號(hào)途徑，完成T細(xì)胞的活化，因此，TCR信號(hào)通路在細(xì)胞免疫方面起關(guān)鍵作用[31]?？偟膩?lái)說(shuō)，上述生物過(guò)程、通路及其相互作用，可能與風(fēng)濕性心臟病密切相關(guān)。

綜上所述，本研究揭示了麻黃加術(shù)湯治療風(fēng)濕性心臟病的主要機(jī)制可能是方劑中的黃酮類(lèi)化合物通過(guò)減低PTGS2、AKT1等介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，減少NOS2、PPARG、IL-6、CXCL8、MAPK3等炎癥因子的表達(dá)，干預(yù)IL-17、TNF、TLR、Th17、TCR等免疫與炎癥相關(guān)通路，從而發(fā)揮抗炎作用，保護(hù)心肌細(xì)胞。本課題組就麻黃加術(shù)湯治療風(fēng)濕性心臟病的關(guān)鍵靶標(biāo)、活性成分、關(guān)鍵信號(hào)通路及其復(fù)雜網(wǎng)狀相互作用關(guān)系進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘及深入探究，為進(jìn)一步進(jìn)行分子機(jī)制研究及臨床應(yīng)用提供了方向和依據(jù)。然而，本研究仍存在一定的局限性，例如中藥在實(shí)際應(yīng)用中的來(lái)源和劑量未能納入研究，今后仍需深入探討。