馮毅， 鄭嵐， 闞競， 楊嵐， 黃帥， 楊來

（1.湖北省中醫(yī)院，湖北武漢 430061；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，湖北武漢 430061；3.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院，重慶 404120）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的以氣流受限為特征的可預(yù)防和治療的呼吸性疾病，常表現(xiàn)為氣流受限不完全可逆，漸進(jìn)性肺功能惡化[1]，且其高患病率、高致殘率、高病死率及病程長等特點給患者及其家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[2]。其發(fā)病機制復(fù)雜，多與香煙煙霧等有害氣體或顆粒對氣道及肺實質(zhì)產(chǎn)生的非特異性炎癥反應(yīng)有關(guān)，主要表現(xiàn)為抗炎因子與促炎因子的失衡，從而產(chǎn)生慢性氣道炎癥[2]。中醫(yī)藥在治療COPD相關(guān)疾病中有著悠久的臨床實踐經(jīng)驗，且療效卓著，COPD是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病名，經(jīng)中醫(yī)學(xué)者反復(fù)論證后，本病在中醫(yī)學(xué)中被歸屬于“肺脹”的范疇，主要癥狀為胸部膨滿、憋悶如塞、喘息上氣、咳嗽痰多、煩躁、心悸、面色晦暗，甚者肢體浮腫等[3]。COPD的臨床辨證分型多樣，其中，肺陽虛學(xué)說經(jīng)過多年的發(fā)展與論證，已被大多數(shù)中醫(yī)學(xué)家所認(rèn)同[4]。肺陽虛證在治療上當(dāng)以補氣溫陽為主。據(jù)臨床觀察發(fā)現(xiàn)，運用補氣溫陽法能提升患者肺功能，對改善患者生活質(zhì)量等方面效果顯著，且較西醫(yī)具有明顯的優(yōu)勢[5]。楊嵐[6]對湖北省中醫(yī)院肺病科2014—2015年收治的60位COPD肺陽虛患者進(jìn)行臨床治療統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，同期患者中使用支氣管舒張劑聯(lián)合補氣溫陽中藥配方治療后病情改善情況顯著優(yōu)于單獨使用支氣管舒張劑治療者。馮毅辨治肺系疾病發(fā)現(xiàn)，補氣溫陽中藥可有效治療不同癥狀的肺陽虛患者[7]。因此，本研究觀察COPD肺陽虛證大鼠模型白細(xì)胞介素（IL）-8、IL-10、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的動態(tài)變化來闡述COPD肺陽虛證的病理機制，使用自擬補氣溫陽中藥對COPD肺陽虛證大鼠進(jìn)行干預(yù)，以期為COPD肺陽虛證的病情評估提供新的依據(jù)，同時也為補氣溫陽法治療COPD肺陽虛證提供更多的實驗依據(jù)。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物清潔級Wistar雄性大鼠50只，平均體質(zhì)量為（200±20）g，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（鄂）2017-0056。實驗于武漢華聯(lián)科模型動物研究院進(jìn)行，于屏障環(huán)境中飼養(yǎng)大鼠，溫度為22～26℃，相對濕度為50%～60%，人工光照明暗各12 h。

1.2藥物及制備自擬補氣溫陽方中藥配方組成：黃芪30 g，白術(shù)12 g，防風(fēng)、桂枝、白芥子、杏仁、肉蓯蓉、補骨脂、炙甘草各10 g，炙麻黃、干姜、五味子各6 g。以上中藥材均由湖北省中醫(yī)院制劑室提供。將上述藥物置于瓦罐中，加水至超過藥物平面，浸泡20 min后，先用武火煮沸，再改用文火煎煮10 min，濾出藥液。藥渣再按照上法煎煮1次，濾出藥液。將2次藥液混合，再武火煮沸即可。然后將此藥液濃縮成成品（生藥量1.0 g/mL），放置于冰箱中冷藏備用。

1.3試劑與儀器脂多糖（LPS）（美國Sigma公司）；“黃鶴樓”牌香煙（湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司）；瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）；大鼠IL-8、IL-10、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測試劑盒（武漢基因美科技有限公司）。有機玻璃熏煙箱（50 cm×40 cm×30 cm）自制；FCD-215SEA低溫可調(diào)式冷柜（青島海爾股份有限公司）；AVL-OPTI動脈血液氣體分析儀（羅氏瑞士公司）；普通顯微鏡（美國奧林帕斯公司）；低溫冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）。

1.4 COPD肺陽虛證大鼠模型制備將50只大鼠隨機分成2組，即正常組10只和造模組40只。將造模組大鼠先以煙熏及氣管內(nèi)滴注LPS的方法建立COPD大鼠模型，再加以寒涼環(huán)境刺激，復(fù)制陽虛證的病因，通過病證結(jié)合的方式構(gòu)建COPD肺陽虛證模型。具體操作步驟：在造模的第1天和第14天，每只大鼠行氣管內(nèi)注入LPS（200μL/次），第2～49天（第14天除外）給予煙熏處理（50 g鋸末和刨花+香煙14支/次，共同點燃制作熏煙環(huán)境，30 min/次，1次/d），煙熏15 min后進(jìn)行寒冷刺激，將大鼠置于可調(diào)冷柜內(nèi)（0～2℃），2次/d，2 h/次[8]。每天固定時間記錄大鼠的飲水量及進(jìn)食量，分別于第1、7、14、28、35、42、49天測量并記錄大鼠背部溫度及肛溫。正常組大鼠不做任何處理，正常飼養(yǎng)。

1.5補氣溫陽方的制備及模型大鼠的分組處理全部造模成功。造模結(jié)束后，將造模組40只大鼠隨機分成4組，即模型組，中藥低、中、高劑量干預(yù)組，每組各10只。中藥低、中、高劑量干預(yù)組根據(jù)人與動物體表面積折算出大鼠用藥劑量，分別給予補氣溫陽方煎液8.0、16.0、32.0 g·kg-1·d-1灌胃，持續(xù)灌胃30 d。模型組大鼠給予16 mL/kg生理鹽水灌胃。

1.6觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 各組大鼠動脈血氣指標(biāo)檢測 將大鼠用20 g/L戊巴比妥鈉以3.0 mL/kg劑量腹腔內(nèi)注射麻醉，采用肝素處理過的注射器行腹主動脈采血，立即進(jìn)行動脈血氣指標(biāo)檢測，分別測定二氧化碳分壓（PaCO2）及氧分壓（PaO2）。

1.6.2 各組大鼠血清中炎性細(xì)胞因子IL-8、IL-10及TNF-α指標(biāo)檢測 經(jīng)大鼠腹主動脈采血，以2 000 r/min離心處理15 min，收集血清。具體檢測步驟按照ELISA試劑盒說明書操作，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣、加酶、溫育、配液、洗滌、顯色、終止及測定等步驟后，分別計算出IL-8、IL-10及TNF-α的實際濃度。

1.6.3 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細(xì)胞（WBCs）、中性粒細(xì)胞（NEUTs）計數(shù) 將大鼠用20 g/L戊巴比妥鈉以3.0 mL/kg劑量腹腔內(nèi)注射麻醉后，常規(guī)皮膚消毒，手術(shù)剪分離氣管前組織，暴露氣管，結(jié)扎遠(yuǎn)心端氣管，用1 mL注射器行氣管插管，注入37℃生理鹽水0.5 mL，反復(fù)抽吸，重復(fù)3次。BALF回收率均在80%以上，收集置于1.5 mL的EP管中。取其中0.2 mL的BALF采用血細(xì)胞計數(shù)法在顯微鏡下進(jìn)行WBCs計數(shù)。另取0.2 mL的BALF，離心重懸細(xì)胞沉淀涂片，晾干后行瑞氏-吉姆薩染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，對中性粒細(xì)胞進(jìn)行分類計算，最終得出BALF中NEUTs的數(shù)量。

1.6.4 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化觀察 BALF收集結(jié)束后，取大鼠的肺組織置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h后，依次進(jìn)行組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、冷凍、切片（約4μm）、貼片、烘片后，進(jìn)行HE染色：切片脫蠟、染色、脫水后再行二甲苯透明，中性樹膠固定封片。光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.7統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠動脈血氣指標(biāo)比較表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠PaO2顯著降低（P<0.01），PaCO2顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量干預(yù)組大鼠PaO2均顯著升高（P<0.01），而PaCO2均顯著降低（P<0.01），均呈劑量依賴性。

表1 各組大鼠動脈血氣指標(biāo)比較Table 1 Comparison of the arterial blood gas indexes in rats of various groups （x±s，mmHg）

2.2各組大鼠血清中炎性細(xì)胞因子IL-8、IL-10及TNF-α指標(biāo)變化比較表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-10水平均顯著降低（P<0.01），IL-8、TNF-α水平均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量干預(yù)組大鼠血清中IL-10水平均顯著上升（P<0.01），而IL-8、TNF-α水平則均顯著降低（P<0.01），均呈劑量依賴性。

表2 各組大鼠血清中IL-8、IL-10及TNF-α變化比較Table 2 Comparison of the levels of serum IL-8，IL-10 and TNF-αin rats of various groups （x±s，pg·mL-1）

2.3各組大鼠BALF中WBCs、NEUTs計數(shù)分析表3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠BALF中WBCs、NEUTs數(shù)量均顯著升高（P<0.01）；而與模型組比較，中藥低、中、高劑量干預(yù)組大鼠BALF中WBCs、NEUTs數(shù)量均不同程度降低（P<0.05或P<0.01），且呈劑量依賴性。

表3 各組大鼠支管肺泡灌洗液（BALF）中WBCs及NEUTs計數(shù)分析Table 3 Analysis of the counts of WBCs and NEUTs in BALF in rats of various groups（x±s，106個·L-1）

2.4各組大鼠肺組織病理學(xué)變化比較圖1結(jié)果顯示：正常組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常連續(xù)，肺泡壁完整，未見炎癥細(xì)胞浸潤。與正常組比較，模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)雜亂，肺泡壁斷裂，膠原纖維增生明顯，肺泡腔明顯擴大，部分融合成肺大皰，同時伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤；與模型組比較，中藥低、中、高劑量干預(yù)組大鼠肺泡破損程度有所減輕，炎癥細(xì)胞數(shù)目減少，肺泡結(jié)構(gòu)逐漸趨于正?；?，其中以高劑量的中藥干預(yù)組大鼠肺組織病理變化改善最為顯著。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the pathologicalchanges in rat lung tissue in various groups（by HE staining method，×200）

3 討論

肺陽虛是慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者的常見病證，貫穿穩(wěn)定期的整個過程[9]。寒邪侵襲，首先犯肺，從而導(dǎo)致肺氣受損、虧盈，陽氣不足，內(nèi)生寒邪發(fā)展為陽虛[7]。臟腑互通[10]，長期肺陽虛則會影響他臟，子病及母，累及脾臟，母病及子，累及腎臟，加之脾虛，無以養(yǎng)腎，導(dǎo)致腎氣虧虛，動則氣喘，長則終致氣損及陽，陰寒內(nèi)生[11]。本研究根據(jù)肺陽虛COPD患者的發(fā)病原因，模擬病因建立肺陽虛證COPD大鼠模型。以香煙煙絲配合鋸末、刨花點燃制煙為外邪，以冰柜環(huán)境制外寒[8]。對模型大鼠采用自擬補氣溫陽中藥進(jìn)行干預(yù)治療，方中：黃芪具有補氣升陽、益衛(wèi)固表之功，直接參與機體的免疫調(diào)節(jié)作用[12]。防風(fēng)具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)靜、抗菌、抗腫瘤、抗過敏、提高機體免疫、抗凝血等藥理作用[13]。黃芪健脾益氣，白術(shù)健脾祛濕，二者可助脾之運化功能恢復(fù)，從而助力組方藥效達(dá)肺經(jīng)[6-7]。黃芪合防風(fēng)，可行祛邪氣而不傷正氣之功[6]。桂枝、麻黃溫通肺陽，干姜、白芥子溫肺化飲，相互配伍使用，共行溫陽化氣之功，以溫補肺陽，溫通肺經(jīng)。配伍苦杏仁，可止咳平喘，肉蓯蓉、補骨脂可補腎納氣、溫腎陽，五味子則行上斂肺氣，下滋腎陰之功[6-7，14]。灸甘草及其提取物具有鎮(zhèn)咳、平喘、痰祛、抗呼吸道病原體、抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等作用[15]，同時，甘草可調(diào)和諸藥藥性，行使藥之職[7，14]。全方配伍使用以達(dá)治療肺陽虛之效。

COPD可導(dǎo)致肺部進(jìn)入的有效氣體量減少，使機體處于相對缺氧的狀態(tài)，可引發(fā)動脈血PaO2降低、PaCO2升高等并發(fā)癥，因此，PaO2和PaCO2可間接反映出機體肺功能[16]。賈琦等[17]通過臨床治療的回顧性分析證明PaO2和PaCO2在COPD的臨床診斷和鑒別診斷上具有重要的借鑒價值，因此，可用于模型的鑒定。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠PaO2顯著降低，PaCO2顯著增加，提示COPD大鼠模型構(gòu)建成功。補氣溫陽法治療COPD肺陽虛證大鼠后，大鼠動脈血PaO2提升，PaCO2降低，提示補氣溫陽法可改善COPD肺陽虛證大鼠肺功能。慢性氣道炎癥刺激是COPD的主要發(fā)病因素之一，參與COPD炎癥反應(yīng)的細(xì)胞通過釋放不同的酶、炎癥介質(zhì)，引起一系列炎癥改變，損傷支氣管內(nèi)皮細(xì)胞，長期慢性的炎癥刺激導(dǎo)致氣道重構(gòu)，引起氣道及肺組織的損傷、氣道阻塞、氣流受限等[18]。長期煙霧及污染的空氣環(huán)境等因素刺激會導(dǎo)致的機體氧化-抗氧化平衡失調(diào)，過剩的氧化物可破壞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生化分子，導(dǎo)致肺部血管、肺組織等的損傷，刺激并加重炎癥反應(yīng)[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，WBCs數(shù)量升高與COPD死亡率相關(guān)，IL-8、IL-10及TNF-α水平也與臨床COPD的治療結(jié)果有關(guān)[21]。NEUTs、嗜酸性粒細(xì)胞增多是COPD加重的標(biāo)準(zhǔn)之一[22]。本次研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)雜亂、肺泡壁斷裂、膠原纖維增生等COPD顯著癥狀，且出現(xiàn)大量WBCs和NEUTs細(xì)胞，進(jìn)一步提示模型組大鼠COPD模型構(gòu)建成功，而經(jīng)補氣溫陽法治療可改善COPD肺陽虛證大鼠肺組織的病理變化，減輕炎癥浸潤，降低血清中促炎因子IL-8、TNF-α水平，升高抗炎因子IL-10水平，且減少WBCs和NEUTs的數(shù)量，提示補氣溫陽中藥可減輕COPD肺陽虛證大鼠炎癥反應(yīng)。

綜上所述，補氣溫陽法能通過調(diào)節(jié)機體促炎-抗炎因子表達(dá)平衡，發(fā)揮減輕COPD肺陽虛證大鼠炎癥反應(yīng)、改善肺功能的作用。