魏璐璐， 吉文偉， 黃維平

（1.河南省南陽市中心醫(yī)院耳鼻喉一病區(qū)，河南南陽 473000；2.河南省南陽市中心醫(yī)院膽道普外科，河南南陽 473000）

鼻咽癌是耳鼻喉科常見的惡性腫瘤，起源于鼻咽部上皮細(xì)胞[1]，受多種因素影響，好發(fā)于我國南方地區(qū)，目前以手術(shù)、放射治療為主要手段[1-2]。盡管手術(shù)、放射治療延緩了部分患者的腫瘤發(fā)展進(jìn)程，但仍有30%～60%的患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和/或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1，3]，因此，尋找增強(qiáng)鼻咽癌敏感性的治療手段，減少腫瘤轉(zhuǎn)移，改善其預(yù)后是亟待解決的問題。中藥因其天然、易得、安全被醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注。淫羊藿為小檗科植物箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.或淫羊藿E.brevicornumMaxim.等的全草，味辛，性溫，入肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、助陽易精、祛風(fēng)除濕的功效[4]，可治療老年慢性氣管炎、風(fēng)濕痹痛、陽痿、早泄等病癥。淫羊藿苷（icariin）是其主要活性成分之一，具有抗骨質(zhì)疏松、抗炎、抗氧化、抗抑郁等廣泛的藥理學(xué)作用[4-6]。近年來，有研究[4-7]表明，淫羊藿苷表現(xiàn)出廣譜的抗腫瘤作用，包括食管癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、成神經(jīng)管細(xì)胞癌等。為進(jìn)一步觀察淫羊藿苷對(duì)鼻咽癌的抑制作用，本研究以鼻咽癌CNE-2細(xì)胞為研究對(duì)象，探討不同濃度淫羊藿苷對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞體內(nèi)外存活及侵襲遷移的影響及機(jī)制，以期為淫羊藿苷臨床治療鼻咽癌提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1藥物及配制淫羊藿苷（批號(hào)：P0057；分子式：C33H40O15；分子量：676.66；純度≥98%）購自上海純優(yōu)生物科技有限公司。用二甲基亞砜（DMSO）配制成1 mol/L母液，使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)稀釋。

1.2主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（美國Gibco公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；鏈霉親和素-過氧化物酶（SP）染色試劑盒（上海翊圣生物有限公司）；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、上皮鈣黏附蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)性鈣黏附蛋白（Ncadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）、磷酸化CaMKⅡ（p-CaMKⅡ）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）等單克隆抗體（美國Abcam公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的免疫球蛋白（IgG）抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.3主要儀器電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀（美國伯樂公司）；Gel View 6000化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（廣州云星儀器有限公司）；Transwell小室（北京優(yōu)尼康生物技術(shù)有限公司）；普通光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.4體外研究

1.4.1 細(xì)胞來源及培養(yǎng) 人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，購自北京中國科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫。以含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行消化傳代。

1.4.2 CCK8法測定細(xì)胞增殖能力 將鼻咽癌CNE-2細(xì)胞接種于96孔板，2×105個(gè)/mL。細(xì)胞貼壁后，按淫羊藿苷終濃度（0、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、20、50、100、200、300、400μmol/L）分組，再分別給予對(duì)應(yīng)處理，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。24 h后，每孔加入10μL CCK8溶液，繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的各孔吸光度（OD），計(jì)算CNE-2細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（OD加藥-ODPBS）/（OD對(duì)照-ODPBS）×100%。根據(jù)細(xì)胞存活率的結(jié)果選擇低細(xì)胞毒性的劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力 在12孔板背面用記號(hào)筆畫出5條平行直線，高溫滅菌后備用。將CNE-2細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于上述12孔板中。細(xì)胞貼壁后，用10μL槍頭垂直于培養(yǎng)板背面的橫線劃痕，用PBS清洗3次。根據(jù)“1.4.2”結(jié)果將細(xì)胞分為4組，分別為空白對(duì)照組（淫羊藿苷0μmol/L），淫羊藿苷10、20、50μmol/L組，培養(yǎng)24 h。隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察CNE-2細(xì)胞遷移情況。

1.4.4 Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲能力 分組同“1.4.3”項(xiàng)。將CNE-2細(xì)胞傳代接種于提前用Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室上層，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，Transwell小室下層則加入正常細(xì)胞培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用無菌棉簽拭去Matrigel基質(zhì)膠和小室上層細(xì)胞，洗滌后用40 g/L多聚甲醛固定小室，再用結(jié)晶紫將遷移至小室下層的CNE-2細(xì)胞染色，流水沖洗去除多余染料并晾干。顯微鏡下每組隨機(jī)選取5個(gè)視野對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.4.5 蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞VEGF、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)水平 將CNE-2細(xì)胞傳代接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，分組同“1.4.3”項(xiàng)，加入不同濃度的淫羊藿苷，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞。用添加蛋白抑制劑的放射免疫沉淀分析（RIPA）蛋白裂解液于冰上裂解細(xì)胞后，提取總蛋白，于4℃離心收集，取上清，用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每組取等量蛋白質(zhì)用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離蛋白后，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到聚偏氟乙烯（PVDF）膜。用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉蛋白質(zhì)2 h后，加入“一抗”VEGF抗體，于4℃孵育過夜。棄去一抗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的對(duì)應(yīng)“二抗”IgG抗體，室溫孵育1 h。滴加電化學(xué)發(fā)光（ECL）液于暗室曝光、顯影，最后分析電泳條帶的灰度值進(jìn)行比較，以GAPDH為內(nèi)參。E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、JNK、p-JNK蛋白的檢測方法同上。

1.5體內(nèi)研究

1.5.1 鼻咽癌CNE-2荷瘤裸鼠模型的構(gòu)建與給藥 5周齡BALB/c裸鼠60只購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司（動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：11400700107330），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。于裸鼠右腋皮下接種鼻咽癌CNE-2細(xì)胞懸液0.2 mL（2×106個(gè)細(xì)胞）構(gòu)建鼻咽癌模型。每天觀察裸鼠一般狀況及移植瘤生長情況。5 d后觀測到成瘤后，將鼻咽癌裸鼠隨機(jī)分為模型組和淫羊藿苷低、中、高劑量組。淫羊藿苷低、中、高劑量組分別腹腔注射淫羊藿苷10、20、50 mg/kg[12]，模型組給予等量基質(zhì)液腹腔注射，每天給藥1次，連續(xù)給藥2周。自給藥后開始計(jì)算，連續(xù)飼養(yǎng)裸鼠30 d，每天記錄裸鼠的存活情況。給藥結(jié)束后，每組隨機(jī)抽取5只裸鼠摘取腫瘤組織并稱質(zhì)量。

1.5.2 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d UTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況 將移植瘤組織制作成4μm厚度的石蠟切片，再進(jìn)行TUNEL染色。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，計(jì)算每個(gè)視野細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，取平均數(shù)。

1.5.3 免疫組織化學(xué)法檢測移植瘤組織中VEGF表達(dá)水平和微血管密度（MVD）取移植瘤組織石蠟切片，嚴(yán)格按照SP染色試劑盒說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，用3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分色，于光學(xué)顯微鏡下觀察VEGF的表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)染色陽性的細(xì)胞核呈棕色顆粒沉著。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，計(jì)算每個(gè)視野的陽性細(xì)胞率，陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%，取平均數(shù)。MVD值：參照Weidner法[13]，隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，觀察并記錄血管數(shù)目，計(jì)算單位面積的微血管數(shù)（條），取其平均數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1淫羊藿苷對(duì)體外培養(yǎng)CNE-2細(xì)胞增殖能力的影響圖1結(jié)果顯示：隨淫羊藿苷濃度的增加，CNE-2細(xì)胞存活率逐漸降低，從10μmol/L開始下降趨勢明顯，100μmol/L及以上濃度時(shí)CNE-2細(xì)胞存活率與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。表明淫羊藿苷可劑量依賴性地降低人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的增殖能力，而當(dāng)終濃度達(dá)到100μmol/L時(shí)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性作用，故采用低細(xì)胞毒性的10、20和50μmol/L劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 淫羊藿苷對(duì)CNE-2細(xì)胞增殖能力的影響Figure 1 Effect of icariin on the survivalability of CNE-2 cells

2.2淫羊藿苷對(duì)體外培養(yǎng)CNE-2細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響圖2-A1、A2結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，淫羊藿苷10、20、50μmol/L組的侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少（P<0.05），且呈濃度依賴性。圖2-B1、B2結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，淫羊藿苷10、20、50μmol/L組的細(xì)胞劃痕愈合率均明顯下降（P<0.05），且呈濃度依賴性。表明淫羊藿苷可劑量依賴性地降低CNE-2細(xì)胞的侵襲遷移能力。

圖2 淫羊藿苷對(duì)CNE-2細(xì)胞侵襲遷移的影響Figure 2 Effects of icariin on the invasion and migration of CNE-2 cells

2.3淫羊藿苷對(duì)體外培養(yǎng)CNE-2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響圖3結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，淫羊藿苷10、20、50μmol/L組腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白VEGF、間質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），而上皮標(biāo)記物E-cadherin的表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），均呈劑量依賴性。

2.4淫羊藿苷對(duì)體外培養(yǎng)CNE-2細(xì)胞CaMKII、JNK磷酸化水平的影響圖4-A1、A2、A3結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，淫羊藿苷10、20、50μmol/L組CaMKII、JNK的磷酸化水平逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且呈濃度依賴性。

圖4-B1、B2結(jié)果顯示：單獨(dú)應(yīng)用10μmol/L JNK抑制劑SP600125預(yù)處理細(xì)胞后，JNK的磷酸化水平較空白對(duì)照組明顯降低（P<0.05）；單獨(dú)用10μmol/L淫羊藿苷處理細(xì)胞時(shí)，JNK磷酸化水平較空白對(duì)照組明顯上調(diào)（P<0.05）；而SP600125與淫羊藿苷聯(lián)用時(shí)，JNK的磷酸化水平較單獨(dú)SP600125預(yù)處理時(shí)明顯增強(qiáng)（P<0.05）。表明淫羊藿苷可減弱JNK抑制劑SP600125對(duì)CNE-2細(xì)胞JNK磷酸化的抑制作用。

圖4 淫羊藿苷對(duì)CNE-2細(xì)胞CaMKⅡ、JNK磷酸化水平的影響Figure 4 Effects of icariin on the phosphorylation levels of CaMKⅡand JNK in CNE-2 cells

2.5淫羊藿苷對(duì)鼻咽癌裸鼠體內(nèi)成瘤的影響圖5-A、B、C結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，淫羊藿苷各劑量組鼻咽癌裸鼠存活率增加，移植瘤質(zhì)量降低（P<0.05），且呈劑量依賴性。

圖5-D1、D2結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，淫羊藿苷各劑量組鼻咽癌裸鼠移植瘤組織細(xì)胞凋亡水平明顯升高（P<0.05），且呈劑量依賴性。

圖5-E1、E2結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，淫羊藿苷20、50 mg組移植瘤組織VEGF陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，且有劑量依賴性。

圖5-F結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，淫羊藿苷各劑量組MVD值明顯降低（P<0.05），且呈劑量依賴性。

圖5 淫羊藿苷對(duì)鼻咽癌裸鼠體內(nèi)成瘤的影響Figure 5 Effects of icariin on tumor growth of nude mice with asopharyngealcarcinoma

3 討論

為探討淫羊藿苷抑制鼻咽癌的潛力，本研究從體內(nèi)外兩方面進(jìn)行了觀察。結(jié)果顯示，淫羊藿苷可抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞、CNE-2荷瘤裸鼠移植瘤的增殖，并可改善鼻咽癌裸鼠的生存率，表明羊藿苷可有效治療鼻咽癌。

具有局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力是惡性腫瘤最主要的生物學(xué)特性，并且是導(dǎo)致患者死亡的最主要原因。腫瘤細(xì)胞通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化獲得耐藥性、干性和侵襲遷移能力，最終導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是其中腫瘤細(xì)胞獲得侵襲遷移能力的誘導(dǎo)性事件，其分子表現(xiàn)為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白中的N-cadherin和Vimentin下調(diào)，E-cadherin上調(diào)，從而促進(jìn)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移[8]。誘導(dǎo)腫瘤血管新生的能力是惡性腫瘤生長、浸潤與轉(zhuǎn)移的前提之一。VEGF是最重要的血管生長促進(jìn)因子，并與多種腫瘤的惡性度及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[9]。因此，抑制腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及增殖和侵襲遷移是腫瘤病情控制的關(guān)鍵[10]，是抗癌藥的重要作用靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，淫羊藿苷能劑量依賴性地抑制體外培養(yǎng)的鼻咽癌CNE-2細(xì)胞侵襲數(shù)目和劃痕愈合率，調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制其體內(nèi)腫瘤生長和VEGF在腫瘤組織中的表達(dá)，表明淫羊藿苷可抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的侵襲遷移能力。

CaMKⅡ是一種多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，JNK是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路的一個(gè)重要分支，它們?cè)诩?xì)胞周期、凋亡和應(yīng)激等生理和病理過程中起著重要作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)被破壞時(shí)，蓄積的Ca2+與鈣調(diào)素相結(jié)合形成復(fù)合物啟動(dòng)CaMKⅡ的磷酸化，而激活后的CaMKⅡ能進(jìn)一步導(dǎo)致JNK的活化，隨后啟動(dòng)線粒體依賴的細(xì)胞凋亡[11-12]。活化的JNK進(jìn)而激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和后續(xù)侵襲遷移過程[13]。Ca2+穩(wěn)態(tài)的失調(diào)是包括鼻咽癌在內(nèi)腫瘤中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生的關(guān)鍵促進(jìn)因素[14]。而與Ca2+穩(wěn)態(tài)相關(guān)的JNK是鼻咽癌進(jìn)展和侵襲的重要促進(jìn)因素[15]。本研究結(jié)果表明，淫羊藿苷能激活CaMKⅡ/JNK信號(hào)通路，并部分抵消JNK抑制劑SP600125對(duì)該通路激活的抑制作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移的抑制作用。

綜上所述，本研究以人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞為研究對(duì)象，初步探討了淫羊藿苷在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中對(duì)CNE-2細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制。結(jié)果表明，淫羊藿苷可抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移特性，其機(jī)制可能與激活CaMKⅡ/JNK信號(hào)通路有關(guān)。本研究初步闡明了淫羊藿苷抗鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的機(jī)制，為淫羊藿苷在臨床治療上的應(yīng)用提供了一定參考。