鐘小蘭， 廖小明， 沈菲， 于海建， 譚麗娟

（廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院，廣東廣州 510800）

登革熱（dengue fever，DF）是由登革熱病毒（dengue virus，DENV）引起的急性傳染病，包含4個血清型（DENV1～DENV4），嚴重者可引起重癥登革出血熱（dengue hemorrhagic fever，DHF）。主要臨床癥狀為發(fā)熱、全身疼痛、皮疹、出血、淋巴結(jié)腫大及白細胞減少等，其發(fā)病率近年來在全球大幅度上升[1-2]。其發(fā)病機制較為復(fù)雜，可能涉及病毒親嗜性、二次感染所致的抗體依賴感染增強作用（antibody-dependent enhancement，ADE）、病毒毒力、免疫機制和宿主基因等因素[3-7]，目前尚無特效治療藥物，主要采取支持及對癥治療的措施。中醫(yī)學(xué)將登革熱歸屬于“濕溫”范疇。吳鞠通《溫病條辨》曰：“頭痛惡寒，身重疼痛，舌白不渴，脈弦細而濡，面色淡黃，胸悶不饑，午后身熱，狀若陰虛，病難速已，名曰濕溫?！痹缙谝郧鍩峄瘽裢副矸槠浠警煼╗8-9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥新加香薷飲合柴葛解肌湯加減辨證治療登革熱衛(wèi)氣同病型療效顯著[10-11]，如縮短患者退熱、疼痛消失時間，提高外周血白細胞、血小板含量，促進CD3+CD8+T淋巴細胞恢復(fù)，降低血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平，然而其治療的分子機制尚不明晰。本研究在前期臨床研究基礎(chǔ)上，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)從全基因組水平探究新加香薷飲合柴葛解肌湯加減辨證治療登革熱衛(wèi)氣同病的分子機制，以期更好地了解登革熱的發(fā)病機制及篩選中藥治療的潛在靶點，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1一般資料收集我院2018年1月至2018年12月登革熱辨證為衛(wèi)氣同病型患者6例，男性3例，女性3例，年齡為（37.9±16.5）歲。就診時癥狀為惡寒發(fā)熱，或不惡寒，頭痛、身骨疼痛，咽部不適，臉部潮紅，疲乏，口微渴。另外，收集年齡、性別與患者相匹配的健康人6例作為正常對照組，男性3例，女性3例，年齡為（38.2±15.7）歲。各組患者在性別、年齡方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究方案已經(jīng)我院倫理委員會批準同意（批準號：2018017）。

1.2診斷標準所選患者均符合2014年制定的《登革熱診療指南（2014年第2版）》[8]中的登革熱診斷標準。

1.2.1 西醫(yī)診斷標準（1）有流行病學(xué)史（發(fā)病前15 d內(nèi)到過登革熱流行區(qū)，或居住地有登革熱病例發(fā)生）；（2）急性起病，首發(fā)癥狀為發(fā)熱，可伴畏寒，24 h內(nèi)體溫可達40℃，發(fā)熱時可伴頭痛，全身肌肉、骨骼和關(guān)節(jié)疼痛，明顯乏力，并可出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等胃腸道癥狀；（3）有白細胞和（或）血小板減少者；（4）單份血清登革熱病毒特異性免疫球蛋白M（IgM）抗體陽性或血清檢測出非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1）抗原或病毒核酸。

1.2.2 中醫(yī)辨證標準 按《登革熱診療指南（2014年第2版）》辨證為衛(wèi)氣同?。壕驮\時癥狀為惡寒發(fā)熱，或不惡寒，頭痛、身骨疼痛，咽部不適，臉部潮紅，疲乏，口微渴。

1.3納入與排除標準（1）符合西醫(yī)診斷標準，且病情未達重癥；（2）符合中醫(yī)衛(wèi)氣同病證型標準；（3）能夠接受口服中藥制劑；（4）排除有自身免疫性疾病、腫瘤及糖尿病等病史者，有精神疾病及不合作者。

1.4治療方式與樣本采集正常對照組無治療；登革熱衛(wèi)氣同病患者分為登革熱組（治療前）、中藥治療組（治療后），在對癥治療的基礎(chǔ)上，基于清熱化濕透表法，給予中藥新加香薷飲合柴葛解肌湯加減，藥物組成：葛根10 g、金銀花15 g、連翹10 g、柴胡10 g、黃芩10 g、淡竹葉15 g、香薷10 g、白扁豆15 g、甘草6 g。每日1劑，早晚分服，療程為5 d。各組均采集空腹靜脈血2.5 mL，用于后續(xù)RNA提取和測序。

1.5 RNA提取與建庫測序使用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）提取每個樣品的總RNA。應(yīng)用Agilent 2100生物分析儀、NanoDrop 2000分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳對每個樣品的總RNA進行定量和鑒定，RNA完整度值（RIN）高于6.5的1μg總RNA用于后續(xù)文庫制備。根據(jù)供應(yīng)商的操作手冊構(gòu)建了下一代測序文庫，使用Qsep100（Bioptic）生物分析儀進行驗證，并使用Qubit 3.0熒光計進行定量，而后根據(jù)制造商的說明加載到Illumina HiSeq儀器上進行150 bp雙端測序獲得原始數(shù)據(jù)。

1.6數(shù)據(jù)前處理應(yīng)用Cutadapt 1.9.1軟件去除測序過程中接頭序列、低質(zhì)量序列。利用Hisat2 2.0.1軟件用于匹配參考基因組序列，進行測序的全基因組比對，而后應(yīng)用HTSeq 0.6.1軟件計算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達量。

1.7候選差異基因篩選應(yīng)用DESeq2（Bioconductor）軟件包，篩選標準設(shè)定為2倍差異變化并且錯誤發(fā)生率（false discovery rate，F(xiàn)DR）低于0.05，即log2（fold change）>1，并且FDR<0.05。分別篩選登革熱組和正常對照組比較，以及中藥治療組和登革熱組比較的差異表達基因，以log2（fold change）為橫坐標，-logFDR為縱坐標做火山圖進行展示，紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)，灰色表示無明顯差異。而后應(yīng)用Venn程序?qū)烧呷〗患鳛橹兴幹委煹臐撛诎谢蜻M行后續(xù)深入研究。

1.8層級聚類（hierarchical cluster）、功能富集、蛋白與蛋白相互作用分析應(yīng)用Cluster 3.0軟件對篩選到的候選基因進行層級聚類分析觀察基因的表達模式，并用基因本體論（GO）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路數(shù)據(jù)庫[12-13]進行功能富集分析，應(yīng)用String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）確定候選基因間的相互作用關(guān)系，并用Cytoscape 3.7.0軟件進行相互作用網(wǎng)絡(luò)可視化，最后應(yīng)用CytoNCA計算各個基因的度（degree），找出網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用的基因（degree>10）。

2 結(jié)果

2.1高通量測序數(shù)據(jù)質(zhì)量基本情況利用Illumina測序儀進行高通量測序，經(jīng)過質(zhì)量控制（QC）分析處理之后，讀長約為148 bp、序列總數(shù)為574 353 880條、總測序量約85.5 Gb的RNA測序數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，平均每個樣品的數(shù)據(jù)量大于7 Gb，變異范圍為6.1～7.4 Gb。以上數(shù)據(jù)符合預(yù)期實驗在測序上的數(shù)據(jù)量，可以進行進一步的基因表達差異分析。

2.2候選差異基因篩選登革熱組與正常對照組比較結(jié)果顯示，有2 704個差異表達基因，其中，1 367個上調(diào)，1 337個下調(diào)，見圖1-a；中藥治療組與登革熱組比較結(jié)果顯示，有882個差異表達基因，其中，上調(diào)404個，下調(diào)478個，見圖1-b。通過Venn圖（見圖1-c），篩選得到2個比較組之間有313個共同基因，以此作為候選基因進行后續(xù)深入分析研究。

圖1 3組候選差異基因篩選Figure 1 Screening the differentialcandidate genes between the three groups

2.3層級聚類分析對313個候選基因進行層級聚類分析，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，中藥治療可以逆轉(zhuǎn)279個基因在登革熱中的表達，例如：IL15在登革熱組中上調(diào)3.27倍，而在中藥治療組中下調(diào)2.01倍；CD69在登革熱患者中上調(diào)2.04倍，中藥治療后下調(diào)了2.70倍；COCH在登革熱患者中下調(diào)3.36倍，而中藥治療后上調(diào)4.19倍。表明中藥新加香薷飲合柴葛解肌湯加減可能通過改變這些基因的表達發(fā)揮其治療登革熱的作用。

圖2 新加香薷飲合柴葛解肌湯加減治療登革熱候選基因的層級聚類熱圖Figure 2 Hierarchical Clustering heat map of candidate genes for dengue fever treated by modified Xinjia Xiangru Yin plus ChaiGe JiejiTang

2.4功能富集分析為了更好地闡釋該279個逆轉(zhuǎn)基因的功能，本研究進行了GO和KEGG信號通路分析，并對前30個結(jié)果進行展示，見圖3。結(jié)果顯示，這些基因大多與免疫功能有關(guān)。例如，SOCS1、FCGR1A、GBP2、GBP1、IRF7、ICAM1、FCGR1B、MT2A、OASL、PML等10個基因參與γ-干擾素介導(dǎo)的信號通路（interferon-gammamediated signaling pathway）；ISG15、IRF7、NFKBIA、TANK、IFIH1、DHX58、CXCL10等7個基因參與維甲酸誘導(dǎo)基因I（RIG-I）樣受體信號通路（retinoic acid-inducible gene I-like receptor signaling pathway）；另外，CCL2、IDO1、IL27、CD274、RIPK2、FAP、PDCD1LG2、IL15、EBI3、CD83等10個基因在T細胞活化的調(diào)節(jié)（regulation of T cell activation）中起作用。

圖3 新加香薷飲合柴葛解肌湯加減治療登革熱候選基因的功能富集分析Figure 3 Function enrichment analysis of candidate genes for dengue fever treated by modified Xinjia Xiangru Yin plus ChaiGe JiejiTang

2.5蛋白與蛋白相互作用、關(guān)鍵基因分析為了獲得新加香薷飲合柴葛解肌湯加減治療登革熱起關(guān)鍵作用的基因，對279個逆轉(zhuǎn)基因進行了蛋白與蛋白相互作用分析，獲得了由187個節(jié)點（基因）和667個連接（相互作用關(guān)系）構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)（見圖4），并篩選出45個可能起重要作用的關(guān)鍵基因（與其他基因連接度不低于10），包括CCL2、CXCL10、IL15等。

圖4 新加香薷飲合柴葛解肌湯加減治療登革熱候選基因的蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 4 Protein-protein interaction analysis of candidate genes for dengue fever treated by modified Xinjia Xiangru Yin plus Chai Ge Jieji Tang

3 討論

轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）可以快速準確地進行基因組序列和表達量的測定，已被用作揭示分子機制、探索診斷和預(yù)測生物標記物的有力工具。RNA-seq也應(yīng)用在登革熱疾病機制研究中。Banerjee等[14]對登革熱患者外周血單個核細胞（PBMCs）中的RNA進行了高通量測序，發(fā)現(xiàn)和炎癥過程相關(guān)的一些基因（MPO、DEFA4、ELANE、AUZ1、CTSG、OLFM4、SLC16A14和CRISP3）較健康人上調(diào)，這可能與登革熱疾病進展相關(guān)。在本研究中，我們對健康人、登革熱患者、中藥治療后登革熱患者的外周全血進行mRNA測序，發(fā)現(xiàn)登革熱患者和健康人之間有2 704個差異表達基因，一些和炎癥免疫過程相關(guān)的基因如MPO、CCL2、IDO1、IL27、IL15、CD83等在登革熱患者中上調(diào)，這些結(jié)果和Banerjee等的發(fā)現(xiàn)具有一定的一致性。另外，我們發(fā)現(xiàn)新加香薷飲合柴葛解肌湯加減治療后279個基因在登革熱中的表達發(fā)生逆轉(zhuǎn)，說明其治療作用可能與這些基因的表達相關(guān)。

GO功能富集和KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)，這些逆轉(zhuǎn)的基因功能主要集中在炎癥免疫相關(guān)的過程，例如：γ-干擾素介導(dǎo)的信號通路（包括SOCS1、FCGR1A、GBP2、GBP1、IRF7、ICAM1、FCGR1B、MT2A、OASL、PML），RIG-I樣受體信號通路（包括ISG15、IRF7、NFKBIA、TANK、IFIH1、DHX58、CXCL10），Toll樣受體信號通路（包括IRF7、TICAM1、CXCL11、NFKBIA、CXCL10）等。干擾素系統(tǒng)由Ⅰ型干擾素（IFN-α，β）、Ⅱ型干擾素（IFN-γ）和Ⅲ型干擾素（IFN-λ1～4）組成，是先天免疫系統(tǒng)抵御病毒的主要機制[15]。當細胞模式識別受體（PRRs）如RIG-I樣受體和Toll樣受體識別病毒時，I型干擾素系統(tǒng)在病毒感染后數(shù)小時內(nèi)被觸發(fā)[16]。這些結(jié)果說明，香薷飲合柴葛解肌湯加減治療可能通過調(diào)節(jié)機體天然免疫應(yīng)答相關(guān)信號通路治療登革熱。另外，我們還發(fā)現(xiàn)和T細胞激活調(diào)節(jié)有關(guān)的基因（包括CCL2、IDO1、IL27、CD274、RIPK2、FAP、PDCD1LG2、IL15、EBI3、CD83）在中藥治療后發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，這也解釋了我們前期研究觀察到的CD3+與CD8+T淋巴細胞亞群在登革熱感染后有明顯異常激活而在中藥治療后得到恢復(fù)[9]的結(jié)果。

我們對這些中藥治療后逆轉(zhuǎn)的基因進行蛋白與蛋白網(wǎng)絡(luò)分析，并且篩選出45個可能起關(guān)鍵作用的基因，包括IRF7、CXCL10、IFIH1、IL15、CD83等。這些基因在炎癥反應(yīng)、自身免疫應(yīng)答以及病毒感染中可能發(fā)揮重要作用。如IRF7是轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）家族成員之一，參與抗病毒與天然免疫應(yīng)答過程[17]，已有研究發(fā)現(xiàn)，其在抵抗登革熱病毒感染過程中發(fā)揮重要作用[18]。若今后對篩選到的這些關(guān)鍵基因進行深入研究可能會發(fā)現(xiàn)登革熱的潛在治療靶點。

本研究采用清熱化濕透表法治療登革熱衛(wèi)氣同病患者，選方新加香薷飲合柴葛解肌湯加減。新加香薷飲見于《溫病條辨》，是祛暑解表、清熱化濕的代表方，其藥性偏涼，主治暑溫兼濕，雖亦惡寒無汗，但有口渴面赤的熱象。香薷發(fā)汗解表，祛暑化濕除滿；金銀花、連翹、白扁豆辛涼透達，滌暑清熱。全方辛溫與辛涼相合，用于暑夾濕邪之證。加入黃芩清熱燥濕、瀉火解毒；葛根解肌清熱生津；柴胡疏導(dǎo)流暢氣機，有助郁熱外泄；淡竹葉淡滲利水，使?jié)駸嶂皬男”憬?；甘草緩急止痛，調(diào)和諸藥。登革熱的致病是全身多系統(tǒng)功能的損害，而非局限于單一器官，因此可能與全身的炎癥反應(yīng)及異常的免疫應(yīng)答相關(guān)。我們前期的研究[10-11]與Fialho等[19]的研究同樣發(fā)現(xiàn)，登革熱可引起異常的免疫反應(yīng)，這種異常的免疫激活不僅不能有效清除病毒，反而導(dǎo)致各種致炎因子的過量釋放加重了全身的炎癥反應(yīng)，引起全身各系統(tǒng)功能受到攻擊，從而出現(xiàn)心、肝、腎等功能紊亂及骨髓抑制，控制這種異常的免疫是病情好轉(zhuǎn)的重要方向。馬力等[20]比較了3種解表劑（桂枝麻黃各半湯、銀翹散、新加香薷飲）對甲1和甲3流感抑制的作用，發(fā)現(xiàn)3種解表劑均可不同程度地提高免疫能力，達到抗病毒作用，而且以新加香薷飲升高CD4、降低CD8更為明顯。馮勁力等[21]進一步分析了新加香薷飲復(fù)方與其組方單藥的抗甲1流感病毒作用，發(fā)現(xiàn)高劑量的新加香薷飲復(fù)方在小鼠肺指數(shù)、死亡保護率和平均存活時間方面均優(yōu)于各單味藥組，其藥效與劑量存在正相關(guān)的關(guān)系。這些研究都說明了新加香薷飲是多靶點的作用機制，不是以單純抗病毒，而是以抗炎及免疫恢復(fù)為主，在中醫(yī)辨證論治指導(dǎo)下的治療獲益將更加明顯。

綜上所述，采用RNA-seq技術(shù)，我們獲得了登革熱經(jīng)中藥新加香薷飲合柴葛解肌湯加減治療后的279個逆轉(zhuǎn)基因以及可能發(fā)揮關(guān)鍵作用的45個基因，新加香薷飲合柴葛解肌湯加減治療登革熱衛(wèi)氣同病的效果可能與炎癥、自身免疫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)，合理的辨證論治是減少登革熱危重癥的重要因素，進一步深入挖掘到的關(guān)鍵基因可為今后有效治療登革熱提供研究靶點。