鄭 敏，黃 穎，汪建中，丁滿萍，李曉紅，，邵劍文，，①

(1.安徽師范大學(xué)：a.生命科學(xué)學(xué)院，b.重要生物資源保護(hù)與利用研究安徽省省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000；2.安徽省績(jī)溪縣雄路苗圃，安徽 宣城 242000)

青錢柳〔Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinsk〕隸屬于胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬(CyclocaryaIljinsk)，為高大落葉喬木。青錢柳為第四紀(jì)冰川孑遺樹種，被稱為“植物界的大熊貓”，是中國(guó)特有的單種屬植物，也是國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物[1]。青錢柳葉中含有豐富的黃酮類、多糖類和萜類等化學(xué)成分[2]，具有抗癌、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血糖、降血脂和保護(hù)肝臟等保健作用[3-9]，已成為食品和藥品工業(yè)研究的熱點(diǎn)[10]。目前，市面上的青錢柳產(chǎn)品主要是春季嫩葉所制的茶，而秋季葉制作的茶口感和賣相均欠佳，基本無茶葉生產(chǎn)價(jià)值。柏明娥等[11]發(fā)現(xiàn)，青錢柳葉中的總黃酮和粗多糖含量隨生長(zhǎng)過程(即成熟度升高)而改變，因此，探究青錢柳葉中具有藥用和保健價(jià)值的化學(xué)成分含量峰值期對(duì)于選擇青錢柳葉適宜采摘期，充分發(fā)揮其保健作用具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，不同種源植物的總黃酮和粗多糖含量差異較大[12-13]。鑒于此，以湖南張家界國(guó)家森林公園、江西銅鼓縣、江西修水縣和安徽五溪山自然保護(hù)區(qū)4個(gè)種源青錢柳葉為研究對(duì)象，對(duì)春季(5月份)和秋季(9月份)各種源葉中的總黃酮和粗多糖含量進(jìn)行比較，以期明確不同種源青錢柳葉中總黃酮和粗多糖含量在春季和秋季的差異，為不同用途青錢柳葉的適宜采摘期確定和優(yōu)良種源篩選提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2015年9月至10月，分別采集湖南張家界國(guó)家森林公園(東經(jīng)110°36′23″、北緯29°32′12″)、江西銅鼓縣(東經(jīng)114°22′02″、北緯28°31′08″)、江西修水縣(東經(jīng)114°32′48″、北緯29°01′35″)和安徽五溪山自然保護(hù)區(qū)(東經(jīng)117°39′32″、北緯29°57′28″)4個(gè)種源的青錢柳種子。參照尚旭嵐等[14]的方法進(jìn)行種子萌發(fā)和種植，由安徽師范大學(xué)邵劍文教授鑒定。于2017年4月17日，將幼苗移植到安徽績(jī)溪縣雄路苗圃基地(東經(jīng)118°32′24″、北緯29°59′24″，海拔160 m，年均溫16.2 ℃，年均降水量1 531.5 mm，年均日照時(shí)數(shù)1 801.8 h，土壤為黃紅壤)。于2019年5月15日，每個(gè)種源選擇10株樣株，每株采集生長(zhǎng)良好且無病蟲害的葉片約60 g；自然風(fēng)干過夜，在35 ℃條件下烘干約1 h，將同株的樣品粉碎后混勻，密封保存于塑封袋中。于2019年9月8日，按照上述方法再次采集相同樣株的葉片并進(jìn)行相同的處理和保存。

實(shí)驗(yàn)使用的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)170402)和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)160415)均購(gòu)自上海展云化工有限公司，且均為分析純；使用的主要儀器有CLT-1型電子調(diào)溫電熱套〔邦西儀器科技(上海)有限公司〕、索氏提取器(揚(yáng)州市滬武玻璃儀器廠)和V-1200紫外-分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶解并配制成質(zhì)量濃度0.20 mg·mL-1母液，用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇分別稀釋成0.00、0.04、0.08、0.12和0.16 mg·mL-1溶液，與母液組成系列梯度溶液，待測(cè)；用純凈水將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度0.10 mg·mL-1的母液，用純凈水分別稀釋成0.00、0.02、0.04、0.06和0.08 mg·mL-1溶液，與母液組成系列梯度溶液，待測(cè)。采用紫外分光光度法[15]分別在415和490 nm下測(cè)定蘆丁和葡萄糖系列梯度溶液的吸光值，均重復(fù)檢測(cè)3次。以吸光值為縱坐標(biāo)(y)、標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合回歸方程。其中，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=10.111x-0.015(R2=0.999 0)，該回歸方程在0.00～1.00 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸線性方程為y=10.355x+0.060(R2=0.996 6)，該回歸方程在0.00～1.00 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2 總黃酮和粗多糖提取 精確稱量干燥的青錢柳葉粉末3.000 g，每株3份。按固液比1∶40加入石油醚，于60 ℃脫脂1 h；加入120 mL體積分?jǐn)?shù)80%乙醇，于80 ℃浸提1.5 h，抽濾，濾液為總黃酮提取液；用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇定容至120 mL，待測(cè)。揮干濾渣，加入120 mL蒸餾水，于90 ℃浸提1.5 h，抽濾，濾液為粗多糖提取液；用蒸餾水定容至120 mL，待測(cè)。

1.2.3 總黃酮和粗多糖含量測(cè)定 參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-16]，將待測(cè)液在室溫下4 000 r·min-1離心10 min；精確量取1 mL上清液，稀釋至適宜濃度，按上述方法分別在415和490 nm下測(cè)定待測(cè)液的吸光值，并計(jì)算待測(cè)液中總黃酮和粗多糖的濃度。按公式“某成分含量=該成分質(zhì)量濃度×稀釋倍數(shù)×120/3.000”分別計(jì)算青錢柳葉中總黃酮和粗多糖的含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用EXCEL 2010和SPSS 19.0軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、方差分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

方差分析結(jié)果表明：青錢柳葉中總黃酮含量在春季和秋季間差異顯著(P<0.05)，且在不同種源間差異極顯著(P<0.01)；其粗多糖含量在春季和秋季間差異極顯著，在不同種源間差異也極顯著。

分析結(jié)果(表1)表明：春季各種源青錢柳葉中總黃酮含量顯著低于秋季，且春季葉中總黃酮含量平均值(20.50 mg·g-1)顯著低于秋季(22.38 mg·g-1)。在春季，湖南張家界國(guó)家森林公園種源葉中總黃酮含量最高，江西銅鼓縣種源次之，且這2個(gè)種源葉中總黃酮含量顯著高于安徽五溪山自然保護(hù)區(qū)種源。在秋季，湖南張家界國(guó)家森林公園種源葉中總黃酮含量最高，顯著高于江西修水縣和安徽五溪山自然保護(hù)區(qū)種源；江西銅鼓縣種源次之，僅顯著高于安徽五溪山自然保護(hù)區(qū)種源。

表1 春季和秋季供試4個(gè)種源青錢柳葉中總黃酮及粗多糖含量的比較

由表1可見：春季各種源青錢柳葉中粗多糖含量均高于秋季，且春季湖南張家界國(guó)家森林公園、江西銅鼓縣和江西修水縣種源葉中粗多糖含量顯著高于秋季；春季葉中粗多糖含量平均值(30.84 mg·g-1)顯著高于秋季(23.74 mg·g-1)。在春季和秋季，4個(gè)種源葉中粗多糖含量均表現(xiàn)為湖南張家界國(guó)家森林公園種源最高，江西省銅鼓縣種源次之，且這2個(gè)種源葉中粗多糖含量顯著高于江西修水縣和安徽五溪山自然保護(hù)區(qū)種源。

3 討論和結(jié)論

本研究結(jié)果表明：青錢柳葉中總黃酮和粗多糖含量在春季和秋季間以及不同種源間均存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)差異。在春季，青錢柳葉中總黃酮含量平均值(20.50 mg·g-1)顯著低于秋季(22.38 mg·g-1)，而粗多糖含量平均值(30.84 mg·g-1)卻顯著高于秋季(23.74 mg·g-1)。據(jù)此認(rèn)為，若以青錢柳葉中總黃酮為主要有效成分開發(fā)抗菌、增強(qiáng)免疫等功效的產(chǎn)品，建議在秋季采摘葉片；若以青錢柳葉中粗多糖為主要有效成分開發(fā)降血糖、抗氧化等功效的產(chǎn)品，建議在春季采摘葉片。不論在春季還是秋季，湖南張家界國(guó)家森林公園和江西銅鼓縣種源青錢柳葉中總黃酮和粗多糖含量均較高，并且這2個(gè)種源葉中粗多糖含量顯著高于江西修水縣和安徽五溪山自然保護(hù)區(qū)種源。春季和秋季湖南張家界國(guó)家森林公園和江西銅鼓縣種源青錢柳葉中總黃酮含量明顯高于同季節(jié)金銀花(LonicerajaponicaThunb.)葉中總黃酮含量(9.72 mg·g-1)[17]，并接近小葉錦雞兒(CaraganamicrophyllaLam)6月份葉中總黃酮含量(22.23 mg·g-1)[18]。春季和秋季4個(gè)種源青錢柳葉中粗多糖含量平均值為22.76～33.68 mg·g-1，均高于安徽舒城和四川沐川種源(分別為12.20和21.7 mg·g-1)[19]。

綜上所述，應(yīng)根據(jù)青錢柳葉不同利用目標(biāo)選擇適宜的采摘時(shí)間，春季宜以粗多糖為利用目標(biāo)，秋季宜以總黃酮為利用目標(biāo)。并且，應(yīng)將湖南張家界國(guó)家森林公園和江西銅鼓縣種源作為青錢柳葉總黃酮和粗多糖利用研究的重點(diǎn)對(duì)象。