張 釗耿楊燁朱 真

(東南大學(xué)電子科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京 210096)

近年來，隨著多學(xué)科交叉的深入發(fā)展及微納加工技術(shù)的進(jìn)步，微流控技術(shù)在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1-3]。由于微流控芯片具有小型化的特點(diǎn)，特征尺寸與細(xì)胞尺度相近、成本低、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)靈活且易于與其他檢測分析手段集成，因此被廣泛用于單細(xì)胞分析[4-6]。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，也稱為出芽酵母，作為一種重要的模式生物，在現(xiàn)代生物學(xué)研究中具有重要意義。而微流控芯片則為酵母單細(xì)胞分析提供了便捷又精準(zhǔn)的研究平臺。

目前，微流控芯片中酵母細(xì)胞的監(jiān)測方法主要是光學(xué)顯微成像技術(shù)[7-9]。通過高分辨顯微鏡能夠獲得出芽酵母單細(xì)胞的形態(tài)、尺寸、生長速率、子細(xì)胞剪切等信息。利用熒光蛋白標(biāo)記亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(液泡、細(xì)胞核、線粒體等)，還能獲得酵母細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化[9]。然而，高分辨率時(shí)序顯微成像技術(shù)的通常需要熒光標(biāo)記，對細(xì)胞的正常生理過程存在一定的影響；此外，大批量的圖像處理耗時(shí)耗力[10]。

相比于顯微成像技術(shù)，電阻抗譜(Electrical impedance spectroscopy，EIS)具有非侵入性、無需熒光標(biāo)記、快速檢測、多參數(shù)讀取等特點(diǎn)[11-13]。電阻抗譜檢測功能可通過微電極集成在微流控芯片中，通過檢測單細(xì)胞的介電特性表征細(xì)胞尺寸、生長狀態(tài)等。例如，Haandbaek 等[14]在微流控芯片中集成微電極，并根據(jù)電阻抗信號對流經(jīng)微流體通道的酵母細(xì)胞的出芽狀態(tài)進(jìn)行區(qū)分。Zhu 等[15]提出一種可以捕獲酵母單細(xì)胞的微流控芯片，并通過電阻抗對單個(gè)出芽酵母的生長及運(yùn)動(dòng)進(jìn)行監(jiān)測、區(qū)分。然而，現(xiàn)有的研究成果還無法實(shí)現(xiàn)對出芽酵母的高通量、長時(shí)間的EIS 監(jiān)測。因此，用于出芽酵母長時(shí)間培養(yǎng)、原位時(shí)序電阻抗監(jiān)測的高通量微流控芯片尚待研究。

本研究提出一種集成高通量酵母單細(xì)胞捕獲結(jié)構(gòu)及微電極陣列的微流控芯片，建立微流控芯片及酵母細(xì)胞的三維有限元模型，分析模型內(nèi)電流分布情況以及不同行列間距下鄰近細(xì)胞對于待測細(xì)胞EIS 信號的影響?？紤]到陣列集成度及檢測靈敏度的需求，根據(jù)仿真分析結(jié)果探索微電極陣列的最優(yōu)行列間距，對基于電阻抗譜的微流控酵母檢測芯片的設(shè)計(jì)優(yōu)化具有重要意義。

1 原理和方法

1.1 微流控芯片的結(jié)構(gòu)及工作原理

如圖1(a)所示，微流控芯片由玻璃襯底、鉻-金微電極陣列、氮化硅絕緣層、SU-8 光刻膠捕獲-剪切結(jié)構(gòu)等組成。微電極陣列是酵母細(xì)胞EIS 檢測的核心結(jié)構(gòu)。如圖1(b)、圖1(b)所示，微電極陣列由列電極(紅色部分)和行電極(藍(lán)色部分)交叉排列而成，SU-8 捕獲-剪切結(jié)構(gòu)則分布于每個(gè)行列電極交叉處。所有行列電極寬度均為10 μm。列電極與行電極表面有一層氮化硅絕緣層，在捕獲-剪切結(jié)構(gòu)上下游分別形成長為15 μm，寬為8 μm 的圓角矩形開孔，用于對出芽酵母的電阻抗檢測。氮化硅絕緣層能夠有效避免微電極陣列間的電流串?dāng)_，提高電阻抗檢測的靈敏度。每個(gè)捕獲-剪切結(jié)構(gòu)以及與之對應(yīng)的絕緣層開孔處的微電極對即為一個(gè)酵母細(xì)胞的捕獲檢測單元。相鄰捕獲檢測單元的列間距設(shè)為Δx、行間距設(shè)為Δy。如圖1(b)、圖1(c)所示，捕獲-剪切結(jié)構(gòu)由2 根對稱的SU-8 微柱組成，微柱高為8.3 μm，2 根微柱的下游開孔寬度為3 μm，與上下游氮化硅開孔距離均為6 μm。圖1(c)為捕獲檢測單元沿AA′的截面示意圖，行列電極的厚度均為0.2 μm，氮化硅層的總厚度為1 μm。具體地，列電極位于玻璃襯底表面，行電極位于厚度為0.5 μm 的第一層氮化硅上表面。

圖1 微流控芯片幾何結(jié)構(gòu)圖

如圖1(b)所示，出芽酵母細(xì)胞以出芽方式進(jìn)行增殖。母細(xì)胞被流體動(dòng)力固定在捕獲-剪切結(jié)構(gòu)中，子細(xì)胞在下游開孔外出芽生長，并最終被流體剪切去除。SU-8 捕獲-剪切結(jié)構(gòu)、被捕獲的出芽酵母細(xì)胞以及周圍的培養(yǎng)液構(gòu)成一個(gè)等效電路系統(tǒng)，酵母細(xì)胞的生長以及子細(xì)胞的剪切均會改變系統(tǒng)的電阻抗。通過捕獲檢測單元上下游的微電極對可以實(shí)現(xiàn)對系統(tǒng)電阻抗的檢測，其原理是對上游激勵(lì)電極施加幅值固定的交流電壓并記錄下游響應(yīng)電極的電流響應(yīng)，基于歐姆定律計(jì)算出系統(tǒng)的電阻抗[16]。幅值、頻率一定的激勵(lì)信號記為，響應(yīng)電流記為，則該系統(tǒng)的復(fù)阻抗為:

對捕獲檢測單元中的出芽酵母進(jìn)行電阻抗檢測時(shí)，施加激勵(lì)信號至與之對應(yīng)的列電極，并檢測相應(yīng)行電極的響應(yīng)電流信號。按照行列尋址的方式選擇不同的行列電極組合，能夠?qū)崿F(xiàn)陣列中所有出芽酵母的電阻抗檢測。根據(jù)式(1)，在激勵(lì)信號不變的情況下，響應(yīng)電流的變化能夠反映系統(tǒng)復(fù)阻抗的變化，進(jìn)而揭示待測出芽酵母的相關(guān)信息，如細(xì)胞的尺寸變化、子細(xì)胞的剪切等。

1.2 細(xì)胞等效模型

出芽酵母細(xì)胞具有細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、內(nèi)層細(xì)胞壁、外層細(xì)胞壁等多層結(jié)構(gòu)，相應(yīng)結(jié)構(gòu)的幾何及材料參數(shù)如表1 所示。

表1 出芽酵母細(xì)胞多層結(jié)構(gòu)的幾何及材料參數(shù)[17]

材料的復(fù)介電常數(shù)和介電常數(shù)、電導(dǎo)率的關(guān)系如下:

由于用于電阻抗檢測的微電極厚度為0.2 μm，遠(yuǎn)大于細(xì)胞膜的厚度(8 nm)，直接使用4 層結(jié)構(gòu)的出芽酵母細(xì)胞建模時(shí)模型中不同結(jié)構(gòu)的尺寸相差過大，會造成網(wǎng)格剖分困難并生成低質(zhì)單元。基于麥克斯韋混合場理論的均質(zhì)等效模型被廣泛用于模擬多層結(jié)構(gòu)球形細(xì)胞的介電性質(zhì)[18]。應(yīng)用麥克斯韋混合場理論可將具有細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的兩層細(xì)胞模型等效為一個(gè)均質(zhì)球，其復(fù)介電常數(shù)為:

如圖2 所示，根據(jù)式(3)，由內(nèi)而外逐層進(jìn)行3次等效，將多層出芽酵母細(xì)胞簡化成具有等效復(fù)介電常數(shù)的均質(zhì)球模型，并根據(jù)式(2)計(jì)算出等效細(xì)胞模型的相對介電常數(shù)和電導(dǎo)率，作為有限元模型中細(xì)胞的材料參數(shù)。

圖2 出芽酵母細(xì)胞多層結(jié)構(gòu)的均質(zhì)等效

1.3 有限元模型

考慮到本研究中電極陣列的排布具有周期性以及良好的對稱性，根據(jù)圖1 所示的微流控芯片結(jié)構(gòu)，以2×2、3×3 2 組捕獲檢測陣列為代表，在COMSOL Multiphysics 軟件中建立對應(yīng)的三維模型進(jìn)行有限元仿真研究。模型中捕獲檢測單元的列間距、行間距分別設(shè)為全局參數(shù)Δx、Δy，便于進(jìn)行行列間距的參數(shù)化掃描。模型中其他結(jié)構(gòu)尺寸參照1.1 節(jié)設(shè)置。

前期研究結(jié)果表明，1 MHz 頻率下的電阻抗幅值信號能夠較好地反映細(xì)胞幾何尺寸的變化[19]。因此，我們利用1.2 節(jié)的等效模型理論計(jì)算1 MHz頻率下母細(xì)胞和子細(xì)胞的等效材料參數(shù)，即相對介電常數(shù)與電導(dǎo)率。有限元模型中其他各結(jié)構(gòu)的材料參數(shù)如表2 所示。

表2 仿真模型結(jié)構(gòu)的材料參數(shù)

應(yīng)用AC/DC 模塊的電流物理場對有限元模型進(jìn)行仿真。仿真模型基于歐姆定律求解電流守恒方程:

式中:σ為電導(dǎo)率，ε0、εr分別為真空介電常數(shù)、相對介電常數(shù)，?U是電勢差。

模型的外部邊界條件設(shè)為電絕緣，內(nèi)部不同域的交界面設(shè)置為電流連續(xù)條件，所有域的電勢初始值設(shè)為0 V。列電極從左到右依次記為S1、S2、S3電極，行電極從上至下依次記為R1、R2、R3電極。仿真中，待測捕獲檢測單元對應(yīng)的列電極為激勵(lì)電極，設(shè)置其終端電壓為幅值1 V，頻率1 MHz 的交流電壓；對應(yīng)的行電極為響應(yīng)電極。非檢測電極設(shè)置為初始值為0 V 的懸浮電位或接地。基于電流守恒方程對模型進(jìn)行有限元求解，并通過全局計(jì)算得出待測出芽酵母細(xì)胞對應(yīng)的響應(yīng)電流。

1.4 仿真計(jì)算

本研究中，以待測母細(xì)胞的子細(xì)胞剪切造成的響應(yīng)電流相對變化量作為判斷電阻抗檢測靈敏度優(yōu)劣的指標(biāo)。非檢測電極不同的設(shè)置對待測細(xì)胞的檢測靈敏度有較大影響，因此需要分別對其設(shè)置成懸浮電位和接地進(jìn)行仿真計(jì)算，從而指導(dǎo)后續(xù)研究。待測細(xì)胞對應(yīng)的響應(yīng)電流會受到其鄰近捕獲檢測單元中細(xì)胞的影響，其中以是否存在鄰近細(xì)胞的影響最為顯著。因此，在芯片設(shè)計(jì)時(shí)，需選擇合適的行列間距以確保鄰近細(xì)胞的存在與否對待測響應(yīng)電流的影響遠(yuǎn)小于目標(biāo)檢測單元中酵母子細(xì)胞剪切產(chǎn)生的信號變化，進(jìn)而通過測得的EIS 信號準(zhǔn)確反映子細(xì)胞的剪切事件。

為方便表示，將第x行第y列被捕獲的出芽酵母細(xì)胞記為Cxy。對出芽酵母細(xì)胞Cxy進(jìn)行EIS 檢測時(shí)，設(shè)置Sx為激勵(lì)電極，Ry為響應(yīng)電極。進(jìn)行有限元仿真求解后，計(jì)算Ry的響應(yīng)電流幅值Iy。為便于分析，對仿真結(jié)果數(shù)據(jù)作以下處理:定義待測出芽酵母Cxy被捕獲與未被捕獲時(shí)響應(yīng)電流幅值Iy的比值為相對幅值A(chǔ)r。待測出芽酵母細(xì)胞的子細(xì)胞剪切以及鄰近細(xì)胞的有無使得相對幅值A(chǔ)r產(chǎn)生的變化量的絕對值記為ΔAr。

首先仿真分析非檢測電極設(shè)置懸浮和接地的C11子細(xì)胞剪切的檢測靈敏度。在陣列大小為2×2的模型中，所有捕獲檢測單元設(shè)有母細(xì)胞，設(shè)置S1電極為激勵(lì)電極，R1電極為響應(yīng)電極。分別將非檢測電極設(shè)置成懸浮和接地，對行間距和列間距為50 μm、75 μm、100 μm、125 μm、150 μm、175 μm、200 μm、225 μm、250 μm、275 μm、300 μm 的全部組合進(jìn)行參數(shù)化掃描求解?；诿恳粋€(gè)參數(shù)化解計(jì)算ΔAr，分別繪制其關(guān)于行列間距的三維柱狀圖，并對比分析。此外，繪制培養(yǎng)液中電流密度模的體箭頭圖，分析響應(yīng)電流I1的組成及分布情況?；诿恳粋€(gè)參數(shù)化解，繪制響應(yīng)電流I1關(guān)于行列間距的三維柱狀圖，分析行列間距變化對I1的影響。

進(jìn)一步研究不同行列間距組合中，單個(gè)鄰近細(xì)胞存在與否造成的ΔAr，并將其與C11子細(xì)胞剪切造成的ΔAr作對比，確定較小的行列間距使鄰近細(xì)胞存在與否造成的ΔAr相對于C11子細(xì)胞剪切造成的ΔAr達(dá)到最低。在陣列大小為3×3 的模型中，被捕獲的母細(xì)胞C11為目標(biāo)細(xì)胞，設(shè)置S1電極為激勵(lì)電極，R1電極為響應(yīng)電極。對行間距和列間距為50 μm、75 μm、100 μm、125 μm、150 μm、175 μm、200 μm、225 μm、250 μm、275 μm、300 μm 的全部組合進(jìn)行參數(shù)化掃描求解，分別研究母細(xì)胞C12、C13、C21、C31、C22存在與否以及C11子細(xì)胞剪切對響應(yīng)電流I1的影響?；诿恳粋€(gè)參數(shù)化解計(jì)算ΔAr，分別繪制ΔAr關(guān)于行列間距的三維柱狀圖進(jìn)行比較。

2 仿真結(jié)果與討論

2.1 非檢測電極設(shè)置懸浮和接地的EIS 檢測靈敏度比較

圖3 非檢測電極的不同設(shè)置對C11子細(xì)胞剪切的影響

如圖3(a)、圖3(b)所示，非檢測電極設(shè)置成懸浮和接地時(shí)，C11子細(xì)胞剪切造成的ΔAr隨行列間距變化的趨勢相似，整體上隨著行列間距增大而逐漸增大。非檢測電極接地時(shí)，C11子細(xì)胞剪切產(chǎn)生的ΔAr更大，其EIS 檢測靈敏度更高。因此，后續(xù)的仿真實(shí)驗(yàn)中非檢測電極均設(shè)置為接地。

2.2 響應(yīng)電流的組成及分布

如圖4(a)、圖4(b)所示，響應(yīng)電極R1記錄的響應(yīng)電流I1由4 部分構(gòu)成，依次記為Ia、Ib、Ic、Id。其中，只有部分Ia流經(jīng)C11所在的捕獲檢測單元，因此只有Ia反映母細(xì)胞C11的幾何尺寸信息。響應(yīng)電流I1中Ia所占的比重越大，對于母細(xì)胞C11的檢測靈敏度越高。Ib流經(jīng)C12所在的捕獲檢測單元，因此C12細(xì)胞存在與否主要影響Ib，進(jìn)而對響應(yīng)電流I1造成影響。C12細(xì)胞的存在使其所在捕獲檢測單元處的電阻抗提高，Ib減小，因此響應(yīng)電流I1減小。C21細(xì)胞存在時(shí)其所在捕獲檢測單元處的電阻抗提高，造成Ic、Id增大，因此響應(yīng)電流I1增大。

圖4 響應(yīng)電流的分布及組成

如圖5 所示，總體上，響應(yīng)電流I1隨著行列間距的增大而減小。在行列間距為200 μm～300 μm時(shí)，響應(yīng)電流I1幾乎不隨行列間距的變化而變化。這是由于此時(shí)行列間距已經(jīng)足夠大，Ib、Ic、Id較小，響應(yīng)電流I1主要由Ia組成，此時(shí)對酵母細(xì)胞C11的EIS 檢測靈敏度較高。

圖5 響應(yīng)電流的幅值變化圖

2.3 鄰近細(xì)胞對響應(yīng)電流的影響

非檢測電極設(shè)為接地，仿真研究不同行列間距組合中單個(gè)鄰近細(xì)胞存在與否以及待測子細(xì)胞剪切造成的ΔAr。圖6(a)～圖6(e)分別反映了待測細(xì)胞C11的鄰近細(xì)胞C12、C13、C21、C31、C22存在時(shí)響應(yīng)電流相對幅值ΔAr隨行列間距的變化。如圖6(a)、圖6(b)所示，總體上來看，隨著列間距的增大，C12細(xì)胞的存在造成了ΔAr顯著減小。由于C12細(xì)胞主要影響Ib，當(dāng)行列間距均在100 μm 以下時(shí)，Ib在I1中所占比重較小，Ib的變化并未引起響應(yīng)電流的顯著變化，因此ΔAr較小。隨著行間距的增大，Ic、Id逐漸減小，響應(yīng)電流中Ib所占比重逐漸增大，因此ΔAr逐漸增大。C13細(xì)胞的存在引起ΔAr的變化相對于C12細(xì)胞的存在小一個(gè)數(shù)量級，因此其影響可以忽略。如圖6(c)、圖6(d)所示，隨著行間距的增大，C21細(xì)胞的存在引起ΔAr顯著減小。這是由于C21主要影響Ic、Id，隨著行間距的增大，Ic、Id逐漸減小，因此ΔAr也逐漸越小。C31細(xì)胞的存在引起ΔAr的變化相對于C21細(xì)胞的存在小一個(gè)數(shù)量級，因此其影響也可忽略。如圖6(e)所示，C22細(xì)胞的存在引起ΔAr的變化比C12、C21細(xì)胞的存在小1 到2 個(gè)數(shù)量級，其影響忽略。待測細(xì)胞C11的子細(xì)胞剪切引起ΔAr的變化如圖6(f)所示?？傮w上，隨著行列間距的增大，C11子細(xì)胞剪切的檢測靈敏度逐漸增大。

圖6 鄰近細(xì)胞的存在及待測細(xì)胞子細(xì)胞剪切對待測響應(yīng)電流的影響

由以上分析可知，與待測細(xì)胞同行或同列的鄰近細(xì)胞對響應(yīng)電流的影響隨著列間距或行間距的增加而顯著下降，并且最鄰近的細(xì)胞對響應(yīng)電流的影響要遠(yuǎn)大于較遠(yuǎn)處的細(xì)胞。與待測細(xì)胞不同行不同列的細(xì)胞對響應(yīng)電流的影響可忽略。因此在確定合適的行列間距時(shí)只考慮C12、C21細(xì)胞的存在對ΔAr的影響，分別將其與C11的子細(xì)胞剪切造成的ΔAr比較。行列間距越大，鄰近細(xì)胞對于響應(yīng)電流的影響越小，目標(biāo)細(xì)胞的檢測靈敏度越高。然而捕獲檢測單元的行列間距過大會降低酵母單細(xì)胞的捕獲效率以及芯片的集成度。因此，綜合考慮檢測靈敏度以及芯片集成度，選擇列間距為100 μm、行間距為125 μm 作為捕獲檢測陣列的設(shè)計(jì)參數(shù)。此行列間距下，C12、C21細(xì)胞存在與否以及C11子細(xì)胞剪切造成的ΔAr分別為1.78×10-4、6.85×10-4、4.66×10-3。與C11子細(xì)胞剪切造成的EIS 信號變化(4.66×10-3)相比，鄰近細(xì)胞對于響應(yīng)電流相對幅值的影響在其15%以下，因此預(yù)期可實(shí)現(xiàn)對待測出芽酵母子細(xì)胞剪切事件的準(zhǔn)確檢測。

3 總結(jié)

在本研究中，我們提出了可用于出芽酵母細(xì)胞電阻抗檢測的集成微電極陣列微流控芯片的設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)，并建立了三維有限元模型，重點(diǎn)研究了微電極陣列的行列間距對細(xì)胞電阻抗檢測靈敏度的影響。通過有限元模型仿真計(jì)算中對捕獲檢測單元的行列間距進(jìn)行了參數(shù)化掃描，分析了微電極陣列中待測響應(yīng)電流的分布及組成，并研究了鄰近細(xì)胞對于待測響應(yīng)電流的影響，確定了有效檢測待測出芽酵母子細(xì)胞剪切所需的最小行列間距組合。所提出的集成微電極陣列微流控芯片有望用于基于電阻抗譜技術(shù)的高通量酵母單細(xì)胞復(fù)制衰老及壽命檢測，建立的有限元模型及仿真分析結(jié)果為微流控芯片的設(shè)計(jì)及優(yōu)化改進(jìn)提供了重要參考。