趙小強 ，鐘源 *，周文期

（1. 甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅農(nóng)業(yè)大學，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，甘肅 蘭州 730070）

玉米（Zea mays）是集糧食、飼料和工業(yè)原料等為一體的高光效C4作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)對保障糧食生產(chǎn)安全和人民生活具有舉足輕重的戰(zhàn)略作用。玉米葉片是重要的同化器官，其通過光合作用在玉米干物質(zhì)累積及產(chǎn)量形成中扮演著重要角色［1?2］，玉米的葉片大小及分布特征與產(chǎn)量呈顯著相關(guān)［3?5］。另外，玉米葉片也是重要的蒸騰器官，其通過與外界進行氣體交換和水分散失進而感受干旱等外界環(huán)境壓力［5?6］，干旱脅迫時玉米的葉長、葉寬和葉面積顯著降低，而葉形系數(shù)、葉片卷曲度和葉片衰老指數(shù)則顯著升高，且玉米通過調(diào)節(jié)這些葉片相關(guān)性狀的變化進而來降低玉米植株對太陽輻射的吸收、蒸騰散失和葉片溫度，最終提高玉米植株的耐旱性［7?10］。因此，深入揭示玉米葉片相關(guān)性狀的遺傳機理，對耐旱節(jié)水高產(chǎn)玉米新品種的培育具有重要的指導意義。

葉面積是衡量玉米葉片特征及耐旱性的重要指示性狀，屬于典型的數(shù)量遺傳性狀，受多個微效基因調(diào)控，且易受環(huán)境影響，遺傳力較低，從而限制了育種中對其遺傳操作的能力［11?13］。近年來，隨著分子標記技術(shù)和分子遺傳學的迅猛發(fā)展，利用分子標記技術(shù)并結(jié)合數(shù)量性狀統(tǒng)計模型發(fā)展而來的數(shù)量性狀位點（quantitative trait locus，QTL）定位方法已成為解析數(shù)量遺傳性狀分子機制的重要手段，且挖掘出的多個主效QTLs 位點，為相關(guān)性狀的遺傳改良、基因克隆和分子標記輔助選擇（marker-assisted selection，MAS）育種提供了有益參考。目前，已有研究對玉米葉面積QTLs（quantitative trait loci）定位進行了遺傳剖析。安允權(quán)等［1］利用M1-7×SYF 構(gòu)建了1 套F2群體，總共定位到了36 個不同葉位葉面積QTLs，位于第1、2、3 和5 號染色體上。張資麗等［2］采用甜玉米自交系T4×T19 構(gòu)建了 1 套 F2群體，總共檢測到了 4 個穗位葉葉面積 QTLs，分布于第 4、5 和 9 號染色體上。Dong 等［11］以Dan232×N04 開發(fā)了1 套RILs（重組自交系recombinant inbred lines）群體，3 種生態(tài)環(huán)境下總共發(fā)現(xiàn)了15 個穗位葉葉面積 QTLs，存在于第 1、2、4、5、7 和 8 號染色體上。劉建超等［14］采用 478×武 312 構(gòu)建了 1 套 RILs 群體，兩年總共檢測到了 7 個穗三葉葉面積 QTLs，位于第 1、2、3、7 和 9 號染色體上。Agrama 等［15］以 SD34×SD35 構(gòu)建了1 套 F3群體，2 種氮素水平下總共識別到了 7 個穗位葉葉面積 QTLs，位于第 1、3、5、8 和 10 號染色體上。甚至，Zhao 等［5］通過 Langhuang×TS141 和 Chang7-2×TS141 構(gòu)建了 2 套 F2∶3群體，8 種水旱環(huán)境下總共發(fā)現(xiàn)了 9 個穗位葉葉面積QTLs，進一步通過meta-QTL（mQTLs）分析，總共挖掘到了10 個穗位葉葉面積mQTLs，存在于1、5、6、8、9 和10 號染色體上，并在這些mQTLs 區(qū)間內(nèi)預測到了11 個相關(guān)候選基因。通過分析以往的研究結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，這些QTLs 只解釋了部分玉米葉面積的遺傳特征，但是干旱脅迫下相關(guān)QTLs 定位的研究較少，不同遺傳背景和環(huán)境下檢測到的葉面積QTLs 位點也不盡相同。因此，在不同遺傳背景及水旱環(huán)境下檢測更多調(diào)控玉米葉面積的QTLs 位點，并分析QTL 與環(huán)境互作（QTL by environment interaction，QTL×E）及上位性互作位點，可為系統(tǒng)揭示玉米葉面積的遺傳機理、確定及克隆相應候選基因/QTLs、并開展耐旱節(jié)水高產(chǎn)MAS 育種奠定理論依據(jù)。因此，本研究以耐旱性和葉片大小差異顯著的玉米自交系TS141 和廊黃/昌7-2 為親本組配了兩套F2∶3群體，在8 種水旱環(huán)境下檢測兩個生育時期玉米相應葉葉面積QTLs，分析QTL×E 及上位性互作位點，挖掘出穩(wěn)定表達的QTLs（stable QTLs，sQTLs）及其區(qū)間內(nèi)的候選基因，進而對玉米葉面積進行全面的遺傳解析，為優(yōu)良自交系的定向遺傳改良、候選基因的克隆及優(yōu)良新品種MAS 育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用的2 套F2∶3群體（POPLT/POPCT）是以耐旱性和葉片大小差異較大的自交系廊黃×TS141/昌7-2×TS141（HLT/HCT）為基礎(chǔ)材料構(gòu)建的［5，16?17］。隨機選擇 2 個 F1雜交種單株自交后獲得了 2 套 F2分離作圖群體，并讓其自交衍生獲得了2 套POPLT和POPCT群體，分別含有202 和218 個家系。其中TS141 來源于Reid 系，廊黃/昌 7-2 為四平頭系［18?20］。

1.2 田間試驗

2014 年 4 月中旬將 2 個親本廊黃和 TS141，相應的 F1雜交種 HLT和 F2∶3群體 POPLT種 植 于 甘 肅 武 威（N 37.97°，E 102.63°，海拔 1508 m）和甘肅張掖（N 38.83°，E 106.93°，海拔 1536 m）。2015 年 4 月中旬將 2 個親本昌7-2 和 TS141，相應的 F1雜交種 HCT和 F2∶3群體 CTPOP種植于甘肅古浪（N 37.67°，E 102.63°，海拔 1785 m）和甘肅景泰（N 37.18°，E 104.03°，海拔1640 m）。這4 個試驗點均設(shè)置干旱脅迫（玉米大喇叭口前期至花期結(jié)束不供水，其他生育時期每隔20 d 供水一次）和正常供水（玉米全生育期內(nèi)只要降水不足時就及時補水）處理［5，21］，每一處理下的所有材料均采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，每一材料3 次重復，單行區(qū)，行長6 m，株距30 cm，行距60 cm，種植密度為55580 株·hm?2。這4 個試驗點玉米生育期內(nèi)平均降水量分別為23.3、19.2、29.3 和27.3 mm，而其年蒸發(fā)量分別為2021、2048、2292 和3038 mm。為了便于供水處理，播種前這4 個試驗點均采用地膜覆蓋于地表并采用滴灌供水，其他管理同一般大田。

每一處理下中間選擇長勢整齊一致的相應親本、F1雜交種及F2∶3群體各10 株，在玉米大喇叭口期（V18）和花期（R1）分別測定第10 片葉和穗三葉葉長（leaf length，LL；LL 為葉基至葉尖的距離）和葉寬（leaf width，LW；LW為葉片中部的寬度），并根據(jù)Dong 等［11］的方法計算不同生育時期相應葉葉面積（leaf area，LA；LA=LL×LW×0.75［11］）。9 月底待玉米成熟時，選擇對應材料收獲，待果穗風干后室內(nèi)考種，測定相應親本、F1雜交種及F2∶3群體穗長（ear length，EL）、單穗重（ear weight，EW）、穗粒重（grain weight per ear，GW）和出籽率（kernel ratio，KR；KR=GW/EW×100%［20］）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用 IBM SPSS 19.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，美國）軟件中的 GLM-Univariate 模型對 2 套 F2∶3群體的相應性狀進行方差分析。參照Knapp 等［22］的方法估算其廣義遺傳力（broad-sense heritability，H2），即式中和σ2分別為基因型方差、環(huán)境方差、基因型與環(huán)境互作方差及誤差，n（n=2）為環(huán)境個數(shù)，r（r=3）為重復數(shù)。參照趙小強等［17］的方法衡量相應性狀的雜種優(yōu)勢大小，即：F1雜種優(yōu)勢指數(shù)（F1heterosis index，HI；HI=F1/MP×100%）、相對雜種優(yōu)勢（relative heterosis，RH；RH=(F1?MP)/F1×100%）、中親優(yōu)勢（mid-parent heterosis，MH；MH=(F1?MP)/MP×100%）、超親優(yōu)勢（over-parent heterosis，OH；OH=(F1?PH)/PH× 100%）和 F2∶3優(yōu) 勢 降 低 率（F2∶3advantage reduction rate，ARR；ARR=(F2∶3?F1)/F1× 100%）；式中：MP為雙親平均值；PH為高值親本。

1.4 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

課題組從玉米基因組數(shù)據(jù)庫MaizeGDB 網(wǎng)站（http：//www.maizegdb.org）中下載了均勻分布于玉米整個連鎖群的872 對SSRs（simple sequence repeats）標記，在廊黃/昌7-2 與TS141 間篩選出了條帶清晰、多態(tài)性明顯的SSRs 標記 213/217 對，其中 202/207 對 SSRs 標記在 2 套 F2群體間掃描后符合 1∶2∶1 的分離比例，并經(jīng) JoinMap 4.0 軟件［23］連鎖分析，199/205 對 SSRs 標記被成功劃分到了 10 個連鎖群中，并選用“Kosambi”函數(shù)計算圖距（cen?timorgan，cM），最終構(gòu)建了 2 套遺傳連鎖圖譜，其分別為 1542.5/1648.8 cM［5，20?21］。這兩套圖譜與參考圖譜 IBM 22008 Neighbors frame 6（http：//www.maizegdb.org/data_center/map）相比，相應的標記順序與其高度一致，進而能夠滿足QTL 定位需求。

1.5 QTL 分析

采用Windows QTLs Cartographer 2.5 軟件的復合區(qū)間作圖法（composite interval mapping，CIM）對單個水分環(huán)境下相應葉葉面積進行QTL 定位。通過1000 次隨機抽樣確定似然值LOD（logarithm of odds，LOD＞3.0）閾值［24］。參照 Stuber 等［25］的方法估算基因的作用方式：|d/a|=|顯性效應值/加性效應值|；A（加性效應 additive ef?fect），|d/a|=0.00～0.20；PD（部分顯性 partial dominance effect），|d/a|=0.21～0.80；D（顯性效應 dominance ef?fect），|d/a|=0.81～1.20；OD（超顯性效應 over-dominance effect），|d/a|＞1.20。參照 McCouch 等［26］的方法進行QTL 命名。

采用QTL Network 2.0 軟件的基于混合線性模型的復合區(qū)間作圖法（mixed linear model based on composite interval mapping，MCIM）聯(lián)合多個水分環(huán)境進行聯(lián)合QTL 定位，并分析QTL×E 及QTL 上位性互作效應。窗口大小設(shè)為 10 cM，Permutation 次數(shù)設(shè)置為 1000 次，用F值（P＜0.05）表示 QTL 的顯著性［27］。若 QTL 中間插入字母“J”表示該QTL 只在聯(lián)合分析時出現(xiàn)，而在單環(huán)境檢測下未出現(xiàn)。根據(jù)Tuberosa 等［28］的標準檢測穩(wěn)定表達的sQTL（stable QTL），即在不同群體或環(huán)境間檢測到同一性狀的QTL，標記區(qū)間相同或置信區(qū)間（confidence in?terval，CI）重疊（距離＜20 cM），則被認定為一個sQTL。

1.6 sQTLs 區(qū)間內(nèi)候選基因檢測及功能分析

采用 MaizeGDB 網(wǎng)站（http：//www.maizegdb.org）中的 Genome Browser 工具將檢測到的 sQTLs 區(qū)間標記信息在玉米物理參考基因組B73 RefGen_v3（http：//www. maizegdb. org）序列信息中進行比對分析，挖掘相應sQTLs 區(qū)間內(nèi)的候選基因。利用 AgBase Version 2.0（http：//agbase.arizona.edu/）在線 GO Slim Viewer 工具對候選基因進行GO（gene ontology）分析［29］。采用KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes；http：//www.kegg.jp/）在線 KEGG Pathway 工具分析相應候選基因的代謝通路［30］。通過 NCBI（national center for biotechnol?ogy information；http：//www. ncbi. nlm. nih. gov）在線 gene 工具對相應候選基因進行 Nr（non-redundant）注釋分析。

1.7 玉米葉發(fā)育相關(guān)候選基因的系統(tǒng)進化分析

采用 MaizeGDB（https：//www. maizegdb. org/data_center）、NCBI 和 CNKI（China national knowledge infra?structure；http：//epub.cnki.net/）搜集已報道的玉米葉發(fā)育相關(guān)候選基因的蛋白序列，并結(jié)合本研究挖掘的相關(guān)候選基因蛋白序列，通過MEGA 7.0 軟件的鄰接法（neighbor joining，NJ）分析玉米葉發(fā)育相關(guān)候選基因的系統(tǒng)進化樹［31］。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米相應葉的葉面積表型鑒定

表型鑒定結(jié)果表明，8 種水分環(huán)境下母本廊黃/昌7-2 與父本TS141 間相應葉（V18時期第10 片葉和R1時期穗三葉）葉面積差異均顯著（P＜0.01 或P＜0.05），且低于父本TS141（表1），表明親本其葉片大小間存在較大的遺傳變異。干旱脅迫時，V18/R1時期不同世代材料的葉面積均顯著降低，其降低程度依次為TS141（25.92%/38.58%）＞HLT（23.72%/30.04%）＞HCT（23.09%/20.15%）＞POPLT（14.52%/16.48%）＞POPCT（11.92%/14.76%）＞昌7-2（7.73%/18.00%）＞廊黃（7.40%/12.40%）（表1，圖1），說明干旱脅迫能夠顯著抑制大喇叭口

表1 親本、F1雜交種及F2∶3群體玉米相應葉的葉面積表型Table 1 Performance of leaf area（LA）for corresponding leaves in parents，F(xiàn)1 hybrids，and F2∶3 populations

圖1 玉米葉面積的水旱變化率和雜種優(yōu)勢分析Fig.1 Rate of change under water-stressed environment and heterosis analysis of leaf area of maize

期和花期玉米相應葉的橫向和縱向生長，進而明顯降低葉面積的大小，且干旱脅迫對旱敏感玉米葉面積的影響程度顯著高于耐旱玉米。因此，葉面積可以作為玉米耐旱性評價的重要參考指標。

兩個F1雜交種與其親本相比，8 種水分環(huán)境下兩個生育時期相應葉的葉面積均顯著大于高值親本，表現(xiàn)為明顯的正向超親優(yōu)勢（20.1%～46.2%），且其F1雜種優(yōu)勢指數(shù)、相對雜種優(yōu)勢、中親優(yōu)勢和F2∶3優(yōu)勢降低率分別表現(xiàn)為156.5%～189.9%、35.1%～47.3%、56.5%～89.9%和?47.5%～?36.9%（圖1）。另外，8 種水分環(huán)境下2 套F2∶3群體兩個生育時期相應葉葉面積的偏度和峰度基本都介于?1.0～1.0，且其廣義遺傳力（H2）均較高，介于59.53%～64.96%（表1），表現(xiàn)出典型的數(shù)量遺傳特性，因此能夠滿足QTLs 分析要求。

2.2 玉米相應葉的葉面積與產(chǎn)量因子間相關(guān)性分析

對2 套F2∶3群體8 種水分環(huán)境下2 個生育時期相應葉的葉面積與產(chǎn)量因子間進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，同一生育時期2 套F2∶3群體相應葉葉面積與4 個產(chǎn)量因子間均顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01），其相關(guān)系數(shù)依次表現(xiàn)為單穗重＞穗軸重＞穗長＞出籽率，說明葉片作為玉米獲取光能量，合成同化物的重要器官，葉片大?。ㄈ~面積）能夠顯著影響玉米各產(chǎn)量因子，進而導致玉米產(chǎn)量的增減。此外，同一F2∶3群體2 個生育時期相應葉葉面積與4 個產(chǎn)量因子間均顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01），且R1時期穗三葉葉面積與4 個產(chǎn)量因子間的相關(guān)系數(shù)顯著大于V18時期第10 片葉葉面積，說明穗三葉的功能在玉米籽粒灌漿及產(chǎn)量形成中占據(jù)更為重要的地位（圖2）。

圖 2 F2∶3群體（POPLT和 POPCT）相關(guān)性狀間的相關(guān)性分析Fig.2 Correlative analysis among corresponding traits in F2∶3 populations（POPLT and POPCT）

2.3 單水分環(huán)境下玉米相應葉葉面積QTLs 定位

采用 CIM 法，在 8 種水分環(huán)境下，2 套 F2∶3群體（POPLT和 POPCT）在 2 個生育時期相應葉葉面積間總共檢測到了 7 個 QTLs 位點，分布于第 1、2、4、6、8 和 10 號染色體上，單個 QTL 的表型貢獻率介于 3.43%（V18時期 POPLT在E2環(huán)境下檢測到的qLA-Ch.4-1）～11.94%（R1時期POPCT在E8環(huán)境下檢測到的qLA-Ch.6-1），其中干旱環(huán)境下定位到了 5 個 QTLs 位點（表 2，圖 3 和圖 4）。

表2 單環(huán)境下采用CIM 法對F2∶3群體相應葉葉面積QTLs 檢測Table 2 QTLs for leaf area were detected in F2∶3 populations by single environment mapping with CIM

圖3 F2∶3群體（POPLT）檢測到的QTLs 及上位性效應QTLs 在遺傳連鎖圖譜上的分布Fig.3 Distribution of QTLs and epistatic QTLs on the corresponding linkage genetic map in F2∶3（POPLT）population

圖4 F2∶3群體（POPCT）檢測到的QTLs 及上位性效應QTLs 在遺傳連鎖圖譜上的分布Fig.4 Distribution of QTLs and epistatic QTLs on the corresponding linkage genetic map in F2∶3（POPCT）population

2.4 不同水分環(huán)境下玉米相應葉聯(lián)合QTLs 及QTL×E 分析

采用MCIM 法，對 2 套F2∶3群體在 2 個生育時期 8 種水分環(huán)境下進行了 QTL 聯(lián)合分析，總共檢測到了 6 個相應葉葉面積聯(lián)合QTLs 位點，單個聯(lián)合QTL 的加性效應表型貢獻率［h2（A）］介于4.82%（POPCT在V18時期下的qLA-Ch.6-1）～9.20%（POPLT在 R1時期下的 qLA-J2-1），其中 2 個（33.3%）聯(lián)合 QTLs 僅在聯(lián)合分析中被檢測到。此外，在 2 套 F2∶3群體下，僅有 1 個聯(lián)合 QTL（POPLT在 R1時期下的 qLA-J2-1）參與了 QTL×E（P＜0.05），該QTL×E 的加性與環(huán)境互作表型貢獻率［h2（AE）］為4.52%（表3，圖3 和圖4）。

表3 多環(huán)境下采用MCIM 法對F2∶3群體相應葉葉面積聯(lián)合QTLs 及QTL×E 分析Table 3 Joint QTLs and QTL×E for leaf area were detected in F2∶3 populations under multiple environments by MCIM

2.5 不同水分環(huán)境下玉米相應葉葉面積sQTLs 確定及候選基因分析

在采用CIM 和MCIM 法分析玉米相應葉葉面積QTLs 的基礎(chǔ)上，進一步確定了6 個玉米相應葉葉面積sQTLs 位點，其分別是位于第1 染色體mmc0041～phi308707 區(qū)間的sQTL；位于第2 染色體bnlg1233～bnlg1520區(qū)間的 sQTL；位于第 4 染色體 umc2041～umc2287 區(qū)間的 sQTL；位于第 6 染色體 umc2040～bnlg1174a 區(qū)間的sQTL；位于第 8 染色體 bnlg1863～umc2075 區(qū)間的 sQTL；位于第 10 染色體 bnlg1655～umc1345 區(qū)間的 sQTL10-1（表2～5）。采用生物信息學方法，在確定的這6 個sQTLs 區(qū)間內(nèi)總共檢測到了463 個編碼基因，通過對這些基因GO、KEGG 和 Nr 注釋后分析發(fā)現(xiàn)，其中 12 個候選基因GRMZM2G014392、GRMZM2G073725、GRMZM2G017087、GRM ZM 2G140667、GRM ZM 2G005990、GRM ZM 2G094497、GRM ZM 2G074122、GRM ZM 2G162434、GRM ZM 2G116079、GRM ZM 2G039113、GRMZM2G119169、GRMZM2G163437為重要的候選基因，其主要調(diào)控玉米葉片發(fā)育、葉綠素含量、分生組織穩(wěn)態(tài)、細胞形態(tài)、細胞分裂、組織特異性表達、光合作用、碳代謝及參與玉米逆境脅迫應答等（表4，5）。

表4 葉面積sQTLs 區(qū)間內(nèi)候選基因檢測及功能分析Table 4 Candidate genes were detected and corresponding function were analyzed in sQTLs intervals for leaf area

表5 葉面積sQTLs 區(qū)間內(nèi)候選基因檢測及功能注釋Table 5 Candidate genes were detected and corresponding function were annotated in sQTLs intervals for leaf area

2.6 不同水分環(huán)境下玉米相應葉葉面積QTL 間上位性效應分析

2 個生育時期8 種水分環(huán)境下對2 套F2∶3群體相應葉葉面積QTL 間的上位性互作效應進行了分析。結(jié)果表明，2 套 F2∶3群體中僅 POPCT群體在 R1時期 E6水分環(huán)境下檢測到了 1 對加性與加性上位性（AA）QTLs 位點（P＜0.05），其位于Bin 1.08～1.10 與Bin 2.08～2.09 處，AA 上位性互作表型貢獻率［h2（AA）］為4.83%（表6）。

表6 多環(huán)境下F2∶3（POPCT）群體相應葉葉面積上位性QTLs 分析Table 6 Epistatic interactions among QTLs for leaf area were analyzed in F2∶3（POPCT）populations under multiple environments

3 討論

3.1 玉米相應葉葉面積的遺傳改良及其在育種的應用

葉面積作為一個衡量玉米葉片大小及分布的典型數(shù)量遺傳性狀，其遺傳機理極其復雜，且與玉米的耐旱性、密植性及抗倒伏性等緊密相關(guān)，進而最終顯著影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，學者已采用加性?顯性?母體遺傳模型（additive?dominance?maternal，ADM）、主基因+多基因遺傳模型（genetic model of major genes plus poly?gene，MG+PG）和多世代聯(lián)合遺傳分析（joint analysis of multiple generations，JAMG）等方法剖析了玉米葉面積的遺傳規(guī)律，其為特定生態(tài)條件下玉米葉面積進行有效地遺傳選擇改良和雜種優(yōu)勢選擇利用奠定了理論基礎(chǔ)。如周東升等［32］采用ADM 模型分析發(fā)現(xiàn)，不同生育時期玉米穗三葉、穗上葉、穗下葉葉面積主要受非加性遺傳體系及基因型與環(huán)境效應的調(diào)控，不宜在早代進行選擇，選擇時還易受環(huán)境條件的影響。馬娟等［33］利用MG+PG模型在PH6WC×7873 組配的6 個世代材料中分析表明，春播/夏播環(huán)境下玉米穗三葉葉面積符合D-2（1 對加性主基因+加性?顯性多基因混合模型）/E-1（2 對加性?顯性?上位性主基因模型），表現(xiàn)為主基因/多基因遺傳體系調(diào)控，因此在不同環(huán)境下應采用單交重組法或簡單回交法對其進行遺傳改良。彭靜等［34］采用JAMG 法在P1、P2、F1、F2、B1和B2多世代材料下研究表明，玉米穗三葉葉面積符合C（加性?顯性?上位性多基因模型），受多個基因位點調(diào)控，且基因間存在上位性互作效應，表現(xiàn)為負向超顯性，減效基因間作用重疊。而本研究采用SSR分子標記和QTL 定位分析發(fā)現(xiàn)，大喇叭口期和花期玉米第10 片葉和穗三葉葉面積主要受非加性效應的調(diào)控，其中部分顯性（PD）、顯性（D）和超顯性（OD）等遺傳效應分別占14.3%、81.0%和4.7%，其還受QTL×E 及AA 上位性互作效應的影響，但影響較小。此外，本研究還表明，兩個生育時期相應葉葉面積的正向超親優(yōu)勢、F1雜種優(yōu)勢指數(shù)、相對雜種優(yōu)勢和中親優(yōu)勢均較大，介于20.1%～189.9%，而相應葉葉面積在F2∶3群體間優(yōu)勢降低率也較明顯，為?47.5%～?36.9%，其與趙小強等［17］和司書麗等［35］的研究相一致，即玉米葉面積的中親優(yōu)勢、超親優(yōu)勢和F2優(yōu)勢降低率分別為47.4%、32.2%和?42.4%，且F1雜交種的葉面積與母本、父本、低親、高親及中親間均顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.470、0.285、0.449、0.497 和0.602。因此，要選育葉面積適宜、株型優(yōu)良及耐旱高產(chǎn)玉米的優(yōu)良新品種時需要注重對基礎(chǔ)材料的選擇，同時要特別考慮對母本、中親和高親的選擇，還需兼顧雜種優(yōu)勢及其優(yōu)勢的衰退，進而提高育種選擇效率。

3.2 玉米相應葉葉面積的QTLs/sQTLs 定位

本研究中，采用CIM 法，在8 種水旱環(huán)境下，2 套F2∶3群體在兩個生育時期相應葉葉面積間總共定位到了7 個QTLs 位點，其中干旱環(huán)境下檢測到了5 個QTLs 位點。說明由于水分環(huán)境的影響，調(diào)控玉米相應葉葉面積的QTLs 在不同水分環(huán)境下會發(fā)生改變，即有些在正常供水環(huán)境下表達的葉面積QTLs 在干旱脅迫環(huán)境下會被抑制，而有些在正常供水環(huán)境下不表達的葉面積QTLs 在干旱脅迫環(huán)境的誘導下則被激活。因此，玉米相應葉葉面積QTLs/基因在不同水分環(huán)境下的特異性表達直接導致了玉米葉生長及特征表型上的差異。另外，采用MCIM法，2 套F2∶3群體在兩個生育時期8 種水旱環(huán)境下進行了QTL 聯(lián)合分析，總共檢測到了6 個相應葉聯(lián)合QTLs 位點，其中2 個聯(lián)合QTLs 位點僅在聯(lián)合分析中被檢測到。

結(jié)合CIM 和MCIM 法，本研究在2 套F2∶3群體間總共定位到了6 個玉米相應葉葉面積sQTLs 位點。如位于第 1 染色體 mmc0041～phi308707（Bin 1.08～1.10）區(qū)間檢測到了 1 個 sQTL 位點，CIM 法中該 sQTL 在 2 套 F2∶3群體的2 個生育時期6 個水分環(huán)境下均被檢測到，MCIM 法中該sQTL 還在2 套F2∶3群體的2 個生育時期均被檢測到。在mmc0041～phi308707 區(qū)間，趙小強等［17］利用2 套F2群體也同樣檢測到了1 個調(diào)控玉米葉面積的sQTL。Zhao 等［5］利用 2 套 F2和 2 套 F2∶3群體在多個水旱環(huán)境下也在 mmc0041～phi308707 區(qū)間檢測到了 1 個同時調(diào)控玉米穗位葉葉長、葉寬、葉面積及葉夾角的sQTL 位點。另外，許誠等［36］采用1 套SSSLs（單片段代換系，single seg?ment substitution lines）群體在 umc1013～dupssr12～umc2047（Bin 1.08）區(qū)間檢測到了 1 個調(diào)控玉米葉面積的QTL，Tang 等［37］通過 1 套 RILs 群體在 bnlg1643～bnlg1597（Bin 1.09）區(qū)間檢測到了 1 個調(diào)控玉米葉片數(shù)的 QTL。郭書磊等［31］還在Bin 1.08 和Bin 1.10 區(qū)間檢測到了2 個調(diào)控玉米葉寬的mQTLs 位點。說明Bin 1.08～1.10 區(qū)間是不同水旱環(huán)境下不同生育時期調(diào)控玉米多個葉相關(guān)性狀的重要“一因多效”位點，其通過調(diào)控玉米的葉夾角、葉長、葉寬、葉面積、葉片數(shù)的發(fā)育，進而影響玉米葉片的空間分布及大小，最終作用于玉米的產(chǎn)量。如位于bn?lg1233～bnlg1520（Bin 2.08～2.09）區(qū)間檢測到了 1 個 sQTL，MCIM 法中該 sQTL 在 2 套 F2∶3群體的 R1時期均被檢測到。鄭祖平等［38］選用1 套RILs 群體也在umc1736～bnlg1520（Bin 2.09）處定位到了1 個調(diào)控玉米穗位葉葉面積的QTL。安允權(quán)等［1］利用1 套F2群體在phi090～umc1256（Bin 2.08～2.09）處檢測到了多個同時調(diào)控玉米穗上第一、第二及第三片葉葉面積的 QTLs 位點。Pelleschi 等［39］發(fā)展了 1 套 RILs 群體，并在 umc5～umc36b（Bin 2.08）處檢測到了多個同時調(diào)控玉米葉片氣孔導度和凈吸收CO2含量的QTLs 位點。印證玉米的Bin 2.08～2.09 處是調(diào)控玉米葉面積的重要區(qū)域，其通過調(diào)控玉米葉面積的大小，進而影響玉米葉片氣孔導度的大小和光合作用中葉片 CO2的固定。如位于第 4 染色體 umc2041～umc2287（Bin 4.08～4.09）區(qū)間檢測到了 1 個 sQTL 位點，CIM 法中其在 POPLT群體的 2 個生育時期 E2環(huán)境下均被檢測到。Zhao 等［5］通過 2 套 F2和 2 套 F2∶3群體同樣在多個水旱環(huán)境下也在umc2041～umc2287 處發(fā)現(xiàn)了多個調(diào)控玉米穗位葉葉面積QTL 位點。另外，Pelleschi 等［39］發(fā)展了1 套RILs 群體還在gsy82_ref?gsy34a_pe（Bin 4.08）區(qū)間發(fā)現(xiàn)了多個同時調(diào)控玉米葉片相對含水量、蒸騰作用、氣孔導度、脫落酸（ABA，abscisic acid）含量、凈吸收CO2含量的QTLs 位點。揭示此Bin 4.08～4.09 處不僅是玉米葉片進行光合作用、呼吸作用的重要位點，而且是玉米響應干旱脅迫應激刺激的重要位點。如位于第8 染色體bn?lg1863～umc2075（Bin 8.03）區(qū)間檢測到了 1 個 sQTL，CIM 法中其在 POPLT群體的 2 個生育時期 E1和 E2環(huán)境下均被檢測到，MCIM 法中其也在 POPLT群體的 2 個生育時期均被檢測到。Zhao 等［5］利用 2 套 F2和 2 套 F2∶3群體在多個水旱環(huán)境下也在bnlg1863～umc2075 區(qū)域定位到了1 個同時調(diào)控玉米穗位葉葉寬、葉面積及葉夾角的sQTL 位點。說明Bin 8.03 處是不同水旱環(huán)境下不同生育時期調(diào)控玉米多個葉相關(guān)性狀的另一個重要“一因多效”位點，該區(qū)域可能是相應基因存在的熱點區(qū)域。此外，本研究還定位到了2 個新的sQTLs 位點，分別位于第6 染色體umc2040～bnlg1174a（Bin 6.05）和第 10 染色體 bnlg1655～umc1345（Bin 10.03）區(qū)域處。因此，Bin 6.05 和 Bin 10.03 位點可為玉米相應葉葉面積的遺傳機理剖析提供新信息。

3.3 玉米葉發(fā)育候選基因挖掘及功能分析

采用生物信息學，本研究在6 個sQTLs 區(qū)間進一步挖掘出了12 個玉米葉發(fā)育相關(guān)候選基因，并對這12 個候選基因進行了GO、KEGG、Nr 注釋及功能分析。結(jié)果表明，GRMZM2G014392在水分虧缺下ABA 作用參與玉米葉片生長［40］。GRMZM2G073725調(diào)控乙烯信號進而作用玉米參與干旱脅迫的響應［41］。GRMZM2G017087調(diào)控玉米P0葉原基的分化形成，并在基部?末端軸向形成過程中表達量會逐漸降低，甚至在發(fā)育成熟的葉片功能區(qū)并未表達，而該基因在葉片發(fā)育過程的末端表達時，葉片中脈發(fā)育提前終止，葉片分叉且卷曲［42］，Lunde 等［43］研究表明GRMZM2G017087在維持玉米分生組織穩(wěn)態(tài)通路中發(fā)揮作用，并能促進玉米葉片的形成。GRMZM2G140667可在干旱脅迫下維持玉米葉片葉綠素含量，進而作用于玉米的光合作用［44］。GRMZM2G005990在玉米碳代謝過程中發(fā)揮著重要作用。GRMZM2G094497參與合成液泡ATP 合酶亞基B，參與玉米細胞代謝。GRMZM2G074122在C4植物中參與光合作用和固碳作用。GRMZM2G162434作用一種重要的MYB 轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長發(fā)育、代謝調(diào)控、細胞形態(tài)及脅迫應答等方面具有重要意義［5］。GRMZM2G116079是一種鋅指蛋白，其在調(diào)控植物細胞分化及響應植物逆境脅迫中扮演重要角色［45］。GRMZM2G039113在玉米細胞骨架排列、細胞分裂及葉片發(fā)育過程中具有重要意義［46］。GRMZM2G119169發(fā)生在玉米組織特異性表達中。GRMZM2G163437參與玉米的光合作用和碳代謝過程［47］。

另外，本研究通過 CNKI（http：//epub.cnki.net/）、NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）收集了郭書磊等［31］通過meta?QTL 分析檢測到的44 個候選基因（其中GRMZM2G017087與本研究結(jié)果相一致，合并為一個候選基因），邢文慧等［48］采用 ILs（Introgression lines）群體檢測到的 7 個候選基因，Zhao 等［5］通過 meta-QTL 分析檢測到的3 個候選基因，趙小強［49］結(jié)合葉片差異較大的兩個親本重測序及BC3F2群體QTL 精細定位后檢測到的1 個候選基因（GRMZM2G019200，其與郭書磊等［31］的研究結(jié)果相一致，合并為一個候選基因），通過MaizeGDB（http：//www.maizegdb.org/data_center）收集到的10 個候選基因，并結(jié)合本研究檢測到的12 個候選基因，總計75 個玉米葉發(fā)育相關(guān)候選基因進行了系統(tǒng)進化分析（圖5）。結(jié)果表明，這75 個玉米葉發(fā)育相關(guān)候選基因被分成了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等3 個進化分支，即第Ⅰ進化分支包括29 個候選基因，其中包含本研究sQTLs 區(qū)間檢測到的5 個候選基因；第Ⅱ進化分支包括10 個候選基因，其中包含本研究sQTLs 區(qū)間挖掘到的1 個候選基因；第Ⅲ進化分支包含36 個候選基因，其中包含本研究sQTLs 區(qū)間發(fā)現(xiàn)的6 個候選基因。說明本研究在6 個sQTLs 區(qū)間內(nèi)挖掘到這12 個葉發(fā)育相關(guān)候選基因與前人挖掘到的葉發(fā)育相關(guān)基因同源性較高，其在玉米葉片發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

圖5 玉米75 個葉發(fā)育候選基因的氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of 75 candidate genes for leaf development via corresponding amino acid sequence in maize

3.4 玉米相應葉葉面積QTL×E 和上位性互作效應分析

Zhao 等［18］研究指出QTL×E 及QTLs 的上位性互作效應是復雜數(shù)量性狀遺傳和雜種優(yōu)勢形成的重要遺傳基礎(chǔ)。因此，在不同環(huán)境下定位到的QTLs 結(jié)果不盡相同。本研究僅在POPLT群體的R1時期檢測到了1 個穗三葉葉面積QTL×E，其位于Bin 2.08～2.09 的bnlg1233～1520 區(qū)域。這與本研究相應葉葉面積聯(lián)合方差分析的結(jié)果相一致。表明玉米相應葉葉面積作為典型數(shù)量遺傳性狀，其普遍存在基因與環(huán)境互作現(xiàn)象，能夠檢測到QTL×E 互作位點，但其效應較小。因此，如何利用玉米相應葉葉面積的QTL×E 互作位點將是今后研究的重點。

另外，本研究還在POPCT群體R1時期檢測到了1 對調(diào)控玉米相應葉葉面積的AA 上位性QTL 位點，其發(fā)生在Bin 1.08～1.10 與 Bin 2.08～2.09 區(qū)間。李賢唐等［50］還采用 1 套 RILs 群體在 Bin 2.05～2.06 與 Bin 3.02～3.03、Bin 2.09～2.10 與 Bin 7.04～7.05、Bin 4.07～4.08 與 Bin 5.04～5.05、Bin 4.07～4.08 與 Bin 5.05～5.06 區(qū)間也檢測到了4 對玉米穗三葉葉面積的AA 上位性QTLs 位點。說明AA 上位性QTLs 位點在玉米相應葉葉面積遺傳中普遍存在，其也能從一定程度上闡述玉米相應葉葉面積基因位點間的內(nèi)在關(guān)系，并在遺傳中可能與主效QTLs位點發(fā)揮同等重要的作用。因此，今后應在更為豐富的遺傳背景下有效地檢測和利用玉米相應葉葉面積上位性QTLs 位點可為玉米葉面積分子遺傳機制的解析提供有效參考。

4 結(jié)論

V18和R1時期玉米第10 片葉和穗三葉葉面積主要受非加性效應的遺傳調(diào)控，還兼受QTL×E 和AA 上位性互作遺傳效應的調(diào)控，但其遺傳效應較小，育種中可采用單交重組法或簡單回交法在玉米生育后期對葉面積進行遺傳改良。V18和R1時期玉米第10 片葉和穗三葉葉面積的正向超親優(yōu)勢、F1雜種優(yōu)勢指數(shù)、相對雜種優(yōu)勢和中親優(yōu)勢均較大，而F2∶3群體優(yōu)勢降低率也較明顯，在選育葉片大小適宜、株型優(yōu)良及耐旱高產(chǎn)玉米優(yōu)良新品種時要注重對基礎(chǔ)材料的選擇，特別要考慮對母本、中親和高親的選擇，還需兼顧雜種優(yōu)勢及優(yōu)勢的衰退，進而提高育種選擇效率。總共檢測到了6 個相應葉葉面積sQTLs，在此區(qū)間挖掘到了12 個調(diào)控玉米葉發(fā)育相關(guān)候選基因，這些候選基因與已收集的其他63 個葉發(fā)育相關(guān)基因都屬于3 個進化分支上。