羅巧玉 ，王彥龍 ，陳志 ，馬永貴 ，任啟梅 ，馬玉壽 *

（1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810008；2. 青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海 西寧 810008）

近年來，由于人類活動加劇、地球環(huán)境不斷變化，人為因素和自然因素致使高寒沼澤濕地健康狀況受損［1?2］。保護濕地的生物多樣性，優(yōu)化濕地植物配置，是目前濕地研究的熱點問題，對于維持濕地生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性等具有重要意義［3?4］。高寒沼澤濕地及邊緣過渡帶具有周期性淹水和出露交替的特征，水分條件經(jīng)常發(fā)生極端干旱或淹水的變化［5］。既耐淹水又耐干旱的“共耐性”植物不多，所以淹露交替造成的過渡帶生境的極端變化，導(dǎo)致很多水生和旱生植物均難以正常生長。發(fā)草（Deschampsia caespitosa）是禾本科（Gramineae）發(fā)草屬多年生草本植物，廣泛分布于高寒草甸、沼澤濕地等生境，具有適應(yīng)性強、耐刈割、種子產(chǎn)量大、發(fā)芽率高等特性［6?7］。發(fā)草耐刈割的特性使其能在小型食草動物（例如草原鼠害）和家畜啃食后迅速進行補償性生長，確保草地生產(chǎn)力的穩(wěn)定，從而減少植被修復(fù)成本，提高修復(fù)效率；而發(fā)草種子產(chǎn)量和發(fā)芽率較高的特性，使其具有產(chǎn)業(yè)化的潛能。因此，發(fā)草是一種理想的退化高寒沼澤濕地植被恢復(fù)植物。目前，關(guān)于發(fā)草的研究僅見于其作為藏嵩草（Kobresia tibetica）、青藏苔草（Carex moorcroftii）群落的伴生種的調(diào)查，包括其分布與起源以及形態(tài)學(xué)特征等［8?9］，對于水分脅迫下發(fā)草的抗逆性特征的研究尚未開展。

水分脅迫是指因水分過多或過少而明顯抑制植物生長的現(xiàn)象［10?12］。干旱、淹水、冰凍、高溫或鹽漬等都能引起水分脅迫。在高寒沼澤濕地及邊緣過渡帶，周期性淹水和出露干旱對植物引起的水分脅迫是最常見的。水分脅迫下植物通過滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)維持一定的細(xì)胞膨壓，使植物體莖葉挺立便于充分接受陽光，使氣孔能正常張開以保證植物光合作用、蒸騰作用等生理過程的正常進行［13?14］。脯氨酸（proline，Pro）是一類廣泛分布的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其具有水溶性高、分子量小、在生理pH 范圍內(nèi)無靜電荷等特點［13，15］。水分逆境條件下植物可以通過增加合成、減少降解和不同器官間的運輸使Pro 在細(xì)胞內(nèi)大量累積，防止?jié)B透脅迫對植物造成傷害［16］。目前，關(guān)于植物 Pro 對干旱［15，17?18］、水澇［19?20］、鹽［21?23］、凍融［14，24?25］等水分脅迫中的響應(yīng)規(guī)律已有較多報道。但同一植物對干旱脅迫和水澇脅迫的耐受/抵御機制不完全相同，有關(guān)從干旱到水澇一系列水分梯度脅迫間發(fā)草Pro 積累以及Pro合成途徑中酶活性、底物及中間產(chǎn)物變化等的比較研究尚未見報道。不同植物Pro 的主要合成部位有異，同一植物在不同脅迫下Pro 的合成部位及在葉片與根系間的轉(zhuǎn)運方式也不盡相同［14，16，24］。因此，本研究以發(fā)草為供試植物，利用盆栽模擬水分脅迫，研究干旱、水澇脅迫下發(fā)草葉片及根系中Pro 積累狀況及其代謝途徑中關(guān)鍵酶和底物的動態(tài)變化，分析發(fā)草Pro 代謝對干旱脅迫和水澇脅迫的響應(yīng)特點，探討不同脅迫下發(fā)草葉片與根系中Pro 的積累、轉(zhuǎn)運規(guī)律，為進一步研究發(fā)草耐受/抵御水分脅迫機制奠定基礎(chǔ)，也為利用發(fā)草開展退化高寒沼澤濕地植被恢復(fù)工作提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

土壤基質(zhì)為河沙和壤土的混合物，其中河沙購買于建材市場，壤土取自青海省果洛藏族自治州瑪沁縣大武鎮(zhèn)高寒草甸，沙和土以1∶1（V∶V）混合均勻。其理化性質(zhì)為：碳2.67%，有機質(zhì)1.45%，全氮0.31%，全磷0.26 mg·g?1，全鉀 19.58 mg·g?1，pH 7.63，全鹽 0.63%，電導(dǎo)率 225.52 μS·cm?1。

供試發(fā)草種子由青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院草原研究所提供，是經(jīng)過多年野生栽培馴化的新品系。挑選飽滿一致、無病害的種子，用2% NaClO 對其進行表面消毒5～10 min，然后用蒸餾水漂洗3～5 次，漂洗干凈的種子備用。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗于青海師范大學(xué)城北校區(qū)進行。該試驗點地處北緯36.742°，東經(jīng)101.749°，海拔2390.6 m，夏季平均氣溫5～20 ℃。2018 年9 月將發(fā)草種子直接播種于裝有3 kg 供試土壤的盆缽（直徑20 mm，高25 mm）內(nèi)，3～5 d 出苗。待幼苗穩(wěn)定后進行定苗，每盆定苗10 株。期間對幼苗進行正常水分管理。冬季將植物轉(zhuǎn)移至溫室過冬，2019 年4 月中下旬天氣轉(zhuǎn)暖時將植物轉(zhuǎn)移至室外露天培養(yǎng)。當(dāng)發(fā)草植株長至25 cm 時，進行水分脅迫處理。水分處理過程中，原地搭建遮雨棚。雨棚兩側(cè)通風(fēng)，不影響溫度和濕度。雨棚內(nèi)放置便攜式氣象儀（霍爾德HED?SQ，中國）監(jiān)測實時氣象數(shù)據(jù)。試驗期間白天（20±2）℃，夜晚（5±2）℃。設(shè)置7 個土壤水分處理［26?27］：重度水澇脅迫（heavy waterlogging stress，HW，植株頂部被淹沒在水下）、中度水澇脅迫（medium water?logging stress，MW，僅植株根頸部被淹，即積水厚度3 cm 左右）、輕度水澇脅迫（light waterlogging stress，LW，田間持水量的100%）、植物正常需水量（control check，CK，田間持水量的70%～80%）、輕度干旱脅迫（light dry stress，LD，田間持水量的50%～60%）、中度干旱脅迫（medium dry stress，MD，田間持水量的30%～40%）、重度干旱脅迫（heavy dry stress，HD，田間持水量的20%）。每個處理設(shè)10 個重復(fù)。試驗采用完全隨機設(shè)計，采用稱重法和土壤水分傳感器（ProCheck，美國）監(jiān)測土壤含水量兩種方式同時進行水分控制［26?28］，每2 d 補充損失水分以控制土壤水分達到處理條件，每次澆水時間為18：00?19：00，并設(shè)置1 個無植物盆土作為對照，估計土壤表面蒸發(fā)水分量。水分脅迫處理共持續(xù)35 d。試驗結(jié)束時將植株從花盆中取出，用大量自來水沖洗干凈，用蒸餾水漂洗后拭干表面水分，將葉片和根系分別裝入凍存管經(jīng)液氮速凍，置于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 測定指標(biāo)與方法 采用酸性茚三酮顯色法［29］測定Pro 含量，參照Lutts 等［30］方法進行酶液提取。采用上海江萊生物科技有限公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定谷氨酸（glutamate，Glu）（貨號：JL48823）、鳥氨酸（ornithine，Orn）（貨號：JL49459）、谷氨酰半醛（glutamic-γ-semialdehyde，GSA）（貨號：JL50039）和 Δ1-吡咯琳-5-羧酸（Δ1-pyrroline-5-carboxylate，P5C）（貨號：JL50033）的含量，以及Δ1-吡咯琳-5-羧酸脫氫酶（Δ1-pyrroline-5-carbox?ylate dehydrogenase，P5CDH）（貨號：JL49227）和 Δ1-吡咯琳-5-羧酸還原酶（Δ1-pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR）（貨號：JL49464）的酶活性，其測定方法詳見試劑盒使用說明。采用 Garca 等［31］的方法測定 Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS）活性：在 100 mmol·L?1Tris?HCl（pH 7.2）緩沖液（包含25 mmol·L?1MgCl2，75 mmol·L?1Glu，5 mmol·L?1ATP，0.4 mmol·L?1NADPH）加入粗酶液啟動反應(yīng)，340 nm下測定吸光值的減少量。參照Charest 等［32］的方法測定鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ornithine aminotransferase，δ-OAT）活性：在 0.2 mol·L?1Tris?KOH（pH 8.0）緩沖液（包含 5 mmol·L?1Orn，10 mmol·L?1α-酮戊二酸，0.25 mmol·L?1NADH）加入粗酶液啟動反應(yīng)，340 nm 下測定吸光值的減少量。參照Lutts 等［30］的方法測定脯氨酸脫氫酶（pro?line dehydrogenase，ProDH）活性：在 0.15 mol·L?1Na2CO3?HCl（pH 10.3）緩沖液（包含 15 mmol·L?1Pro，1.5 mmol·L?1NAD+）加入粗酶液啟動反應(yīng)，340 nm 下測定吸光值的增加量。以上指標(biāo)每處理重復(fù)測定3 次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用LSD 法在顯著水平為5%條件下進行比較，當(dāng)P＜0.05 時，差異顯著。數(shù)據(jù)結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并用Excel 2007 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分脅迫對發(fā)草地上/地下部分Pro 含量的影響

水分脅迫下發(fā)草的生長受到抑制，隨著水分脅迫程度加劇及脅迫時間增長，植物受到的抑制作用越明顯。輕度干旱和中度干旱脅迫下發(fā)草的葉片由鮮綠柔軟變綠變硬，葉面積變小，葉片數(shù)減少，根系長度增加，根冠比增大。重度干旱脅迫下發(fā)草葉片變成墨綠泛白狀態(tài)，隨著干旱脅迫時間增長，葉片不斷萎蔫，處理21 d 后植株死亡。輕度水澇和中度水澇處理下發(fā)草葉片顏色變化不明顯，但是新葉的形成受到抑制，葉片數(shù)變少，根系減少。重度水澇處理下隨著脅迫時間增長，葉片發(fā)黃，根尖變褐變黑，葉片及枯落物腐爛發(fā)臭，處理28 d 后地上部分全部腐爛、部分根系腐爛。

對照發(fā)草地上部分 Pro 含量為 58.82 μg·g?1，干旱脅迫和水澇脅迫均使發(fā)草植物Pro 含量顯著增加（P＜0.05）。中度干旱處理下發(fā)草地上部分Pro 含量達到 142.10 μg·g?1，是對照的 2.4 倍；中度水澇處理下發(fā)草地上部分 Pro 含量達到 120.36 μg·g?1，約是對照的2.0 倍。不同的水分脅迫對發(fā)草根系的抑制作用與地上部分的抑制作用基本一致，相同的水分處理下發(fā)草根系和葉片中Pro 含量相差不大（圖1）。上述結(jié)果表明，干旱到水澇的系列水分脅迫下發(fā)草地上部分和根系中Pro 含量均顯著增加，從而參與滲透調(diào)節(jié)來抵制逆境。

圖1 不同水分處理下發(fā)草地上/地下部分的Pro 含量Fig. 1 Proline content in the shoot/root of D. caespitosa un?der different water treatments

2.2 水分脅迫對發(fā)草地上/地下部分Pro 代謝底物和中間產(chǎn)物含量的影響

植物Pro 代謝途徑包括Glu 途徑和Orn 途徑，Glu和Orn 分別是這兩種代謝途徑中的底物。對照和輕度水澇處理下發(fā)草地上部分Glu 含量很高，分別達到18.64 和 19.35 μg·g?1。但是中度水澇、輕度干旱和中度干旱處理下發(fā)草地上部分中Glu 含量顯著下降（P＜0.05），最低只有11.46 μg·g?1（圖2）。對于根系而言，不同水分脅迫的抑制作用與對地上部分的抑制作用基本一致，相同的水分處理下發(fā)草根系中的Glu 含量大于地上部分的含量。對照發(fā)草地上部分Orn 含量最高，達到5.73 μg·g?1。干旱脅迫和水澇脅迫均使發(fā)草地上部分Orn含量顯著下降（P＜0.05），中度水澇條件下發(fā)草地上部分Orn 含量只有1.74 μg·g?1，約是對照的1/3（圖2）。對于根系而言，輕度干旱脅迫與輕度水澇脅迫下Orn 含量與對照沒有顯著差別，但是中度干旱脅迫和中度水澇脅迫使植物Orn 含量顯著降低（P＜0.05）。相同的水分處理下發(fā)草根系中的Orn 含量與地上部分的含量相差不大。上述結(jié)果表明，干旱到水澇的系列水分脅迫下發(fā)草地上部分和根系中Glu 和Orn 含量均顯著減少，從而參與Pro 代謝途徑以生成更多Pro。

圖2 不同水分處理下發(fā)草地上/地下部分Pro 代謝底物Glu 和Orn 的含量Fig. 2 Glu and Orn content in the shoot/root of D. caespitosa under different water treatments

GSA 和P5C 是植物Pro 合成途徑中的中間代謝產(chǎn)物。對照發(fā)草地上部分GSA 含量最低，為1.26 μg·g?1。輕度水澇、輕度干旱和中度干旱處理下發(fā)草地上部分中GSA 含量顯著升高（P＜0.05），最高達2.65 μg·g?1。干旱脅迫及中度水澇脅迫下發(fā)草根系GSA 含量與對照沒有顯著性差異，輕度水澇脅迫下發(fā)草根系GSA 含量顯著升高，為2.14 μg·g?1。相同水分處理下發(fā)草地上部分和根系中GSA 含量間沒有顯著差異（圖3）。從圖3 發(fā)現(xiàn)，干旱到水澇的系列水分脅迫下發(fā)草地上部分P5C 含量變化趨勢與GSA 變化趨勢一致。對于根系而言，對照P5C 含量與輕度干旱脅迫、輕度水澇脅迫間沒有顯著差別，但是中度干旱脅迫、中度水澇脅迫下P5C 含量均分別顯著低于輕度干旱脅迫和輕度水澇脅迫（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，水分脅迫下Glu 和Orn 在酶的作用下生成大量GSA，而GSA 和P5C 可以自發(fā)地相互轉(zhuǎn)化，因此GSA 含量的升高導(dǎo)致P5C 含量的升高。

圖3 不同水分處理下發(fā)草地上/地下部分Pro 代謝中間產(chǎn)物GSA 和P5C 含量Fig. 3 GSA and P5C content in the shoot/root of D. caespitosa under different water treatments

2.3 水分脅迫對發(fā)草地上/地下部分Pro 代謝關(guān)鍵酶活性的影響

P5CS、P5CDH、δ-OAT、P5CR 和 ProDH 是植物 Pro 合成途徑中的關(guān)鍵酶。P5CS 是 Glu 途徑中的限速酶，Glu 在P5CS 的催化作用下生成GSA，進而生成Pro。根據(jù)表1 可知，水澇脅迫和干旱脅迫下發(fā)草地上部分及根系中P5CS 活性均顯著增強（P＜0.05），地上部分與根系P5CS 活性相差不大。Glu 途徑中Glu 生成GSA 是可逆反應(yīng)，P5CDH 是逆反應(yīng)的催化酶。水澇脅迫下發(fā)草地上部分P5CDH 活性沒有顯著變化，但是干旱脅迫顯著抑制了P5CDH 活性（P＜0.05）。對根系而言，水澇脅迫和干旱脅迫下P5CDH 活性均顯著低于對照（P＜0.05）。地上部分和根系中P5CDH 活性相差不大。δ-OAT 是Orn 途徑中的關(guān)鍵酶，可將Orn 轉(zhuǎn)化為GSA，進而合成Pro。對照發(fā)草地上部分δ-OAT 活性最低，僅為20.85 U·g?1，輕度干旱和輕度水澇處理下δ-OAT 活性顯著增強（P＜0.05）。對根系而言，水澇到干旱的系列水分脅迫均顯著提高δ-OAT 活性（P＜0.05）。發(fā)草地上部分δ-OAT 活性高于根系。P5CR 是Pro 生物合成通路上的一個關(guān)鍵酶，可將P5C 還原成Pro。對照中發(fā)草地上部分P5CR 活性最低，為11.35 U·g?1。水澇脅迫和中度干旱脅迫均顯著提高P5CR 活性。根系中P5CR 活性變化趨勢與地上部分基本一致，但地上部分P5CR 活性高于根系。ProDH 是Pro 降解反應(yīng)的限速酶，將Pro 降解為P5C。在干旱脅迫下，發(fā)草地上部分ProDH 活性顯著下降，以此來減緩Pro 的降解。干旱到水澇的系列水分脅迫對發(fā)草根系中ProDH 活性沒有顯著性影響。發(fā)草地上部分和根系中ProDH 活性沒有顯著性差異。

表1 不同水分處理下發(fā)草地上/地下部分Pro 代謝關(guān)鍵酶的活性Table 1 Activity of key enzymes in Pro metabolism in the shoot/root of D.caespitosa under different water treatments（U·g-1 FW）

2.4 發(fā)草地上/地下部分Pro 代謝中各代謝物、關(guān)鍵酶之間的相關(guān)性

對水分脅迫下發(fā)草地上部分Pro 代謝途徑中Pro、Glu、Orn 等10 個指標(biāo)進行Pearson 相關(guān)性分析（表2），結(jié)果表明：發(fā)草地上部分Pro 含量與P5CS 和P5CR 活性具有極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）；Glu 含量與P5C 含量具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），與 P5CS、P5CDH 和 ProDH 活性具有顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；Orn 含量與 GSA含量具有極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與P5C 含量和δ-OAT 活性具有顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；GSA、P5C含量與δ-OAT 活性均具有顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；P5CR 活性與P5CS 和P5CDH 活性分別具有極顯著（P＜0.01）和顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。

表2 發(fā)草地上部分Pro 代謝中各代謝物、關(guān)鍵酶之間的相關(guān)性Table 2 Correlation analysis of metabolites and key enzymes in Pro metabolism in the shoot of D.caespitosa

根據(jù)水分脅迫下發(fā)草地下部分Pro 代謝途徑中各代謝物、關(guān)鍵酶之間的相關(guān)性分析（表3）發(fā)現(xiàn)，發(fā)草地下部分Pro 含量與P5CDH 活性具有極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）；Glu 含量與Orn 和P5C 含量具有極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與 P5CR 和 δ-OAT 活性具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；Orn 含量與P5C 含量和 P5CR 活性具有極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與 GSA 含量和 δ-OAT 活性具有顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；GSA 含量與 P5CS 和

P5CR 活性均具有極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與P5C 含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），與P5CDH 活性存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）；P5C 含量與P5CR 活性存在極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與P5CDH 活性存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。

表3 發(fā)草地下部分Pro 代謝中各代謝物、關(guān)鍵酶之間的相關(guān)性Table 3 Correlation analysis of metabolites and key enzymes in Pro metabolism in the root of D.caespitosa

3 討論

3.1 水分脅迫對發(fā)草Pro 含量變化的影響

植物通過調(diào)節(jié)體內(nèi)各個系統(tǒng)來適應(yīng)或緩解逆境對自身的傷害，而滲透調(diào)節(jié)是植物防御機制的第一道防線。滲透脅迫下，植物通過快速積累Pro、甜菜堿等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)維持植物細(xì)胞膨壓和生物活性分子構(gòu)象［18?19］。Pro是分子透性最大、極易溶于水的相容性滲透劑和抗氧化劑，在抵抗?jié)B透脅迫中發(fā)揮重要作用［17，24］。大量研究表明，植物受到干旱、水澇等水分脅迫時會通過積累Pro 來增強對逆境的抵抗能力［33?34］，Pro 含量的多少與植物抗旱、抗鹽性具有正相關(guān)關(guān)系［18?19］。本研究結(jié)果表明，干旱到水澇的系列水分脅迫下，發(fā)草地上部分和地下部分Pro 含量均顯著升高（P＜0.05），說明發(fā)草通過在地上部分和地下部分積累Pro 來緩解水分脅迫損傷。通常Pro幫助植物耐受/抵御水分脅迫是多種途徑綜合作用的結(jié)果：Pro 的積累可導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓濃度提高，進而驅(qū)使水分進入細(xì)胞或降低水分從細(xì)胞中流出，為細(xì)胞膨脹提供膨壓，保護滲透平衡和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定［23］；Pro 和酶相互作用可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，保持細(xì)胞膜完整性，防止膜蛋白變性［20］；Pro 具有保護光復(fù)合物Ⅱ的作用［35］，在光合作用中Pro 調(diào)節(jié)胞質(zhì)酸堿度、提高光系統(tǒng)Ⅱ介導(dǎo)的光化學(xué)活性［36］。同時，Pro 是易于利用的能量資源，氧化1 分子Pro 可以產(chǎn)生30 個ATP，是逆境中植物的碳、氮和能量庫［37］。因此，逆境中植物體內(nèi)Pro 含量升高既可能是植物適應(yīng)性的表現(xiàn)，也可能是植物細(xì)胞受損的表征［17?19］。本研究中發(fā)草植株內(nèi)Pro 含量的升高是主動積累的過程，地上部分與根系積累的Pro 含量相差不大。李丹陽等［38］在研究玉竹（Polygonatum odoratum）的Pro 代謝途徑時發(fā)現(xiàn)Pro 的積累主要發(fā)生在光合器官、生殖器官等代謝旺盛的部位，認(rèn)為這是植物在滲透脅迫下的一種生態(tài)適應(yīng)的“保命”策略，本研究結(jié)果與其不一致，可能是不同植物間存在的差異所致，有待進一步研究。

3.2 水分脅迫對發(fā)草Pro 代謝關(guān)鍵酶活性變化的影響

脅迫條件下Pro 的積累可能存在多種原因，一方面是Pro 合成代謝加快，另一方面是Pro 氧化分解速率降低［13］。Pro 的生物合成途徑有 2 條，包括以 Glu 為前體的 Glu 途徑和以 Orn 為前體的 Orn 途徑［14］。這兩種合成途徑在 Pro 積累中的作用隨物種、生境因素的不同而不同［18?20］。Glu 途徑中 Glu 生成 GSA 是可逆反應(yīng)，P5CS 是 Glu途徑中的限速酶，P5CDH 是逆反應(yīng)的催化酶［22?23］。δ-OAT 是 Orn 途徑中的關(guān)鍵酶［24?25］。Pro 降解過程是合成過程的逆過程，PorDH 是Pro 降解過程中的限速酶［22?23］。因此，水分脅迫下，植物體內(nèi)Pro 代謝關(guān)鍵酶活性變化直接決定著Pro 的合成和分解代謝。本研究中，干旱脅迫和水澇脅迫下，發(fā)草植株內(nèi)Glu 途徑中底物Glu 的含量和Orn途徑中底物 Orn 的含量均顯著下降（P＜0.05），同時，P5CS 活性、δ-OAT 活性、P5CR 活性均顯著增強（P＜0.05），表明Pro 合成代謝中Glu 途徑和Orn 途徑共同加強。而P5CDH 和ProDH 活性顯著降低（P＜0.05），表明Pro 分解代謝受到抑制。這說明水分脅迫條件下發(fā)草根系和地上部分中Pro 含量升高是通過合成代謝的加強和分解代謝的抑制而主動積累的結(jié)果，這與Das 等［20］的研究結(jié)果相似。本研究中，水分脅迫下Glu 和Orn 分別在P5CS 和δ-OAT 作用下生成大量GSA，但P5CDH 的活性降低，所以只有少量的GSA 再次轉(zhuǎn)變?yōu)镚lu。同時GSA 和P5C 可以自發(fā)地相互轉(zhuǎn)化，GSA 和P5C 的含量均升高。Pro 合成的2 條途徑對滲透脅迫下Pro 積累的貢獻還存在較多的爭議。本研究中，水分脅迫下發(fā)草地上部分Glu 含量和Orn 含量均顯著下降（P＜0.05），根系中僅Glu 含量顯著下降（P＜0.05）而Orn 含量沒有顯著變化。相同的水分處理下地上部分Glu 含量小于根系。同時，地上部分δ-OAT 活性強于根系。這表明發(fā)草地上部分Pro 的積累由Glu 途徑和Orn 途徑協(xié)同作用，但根系中Pro 的積累以Glu 途徑為主。根系中Glu 含量與Orn 含量具有極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），一方面可能是由于水分脅迫下植物體內(nèi)P5CS 活性會受到Pro 反饋調(diào)節(jié)，而δ-OAT 活性則不受Pro 反饋抑制。另一方面，P5CS mRNA 和δ-OAT mRNA 的表達可能與植物體內(nèi)氮素水平有關(guān)，滲透脅迫及低氮條件下以Glu 途徑為主；非滲透脅迫及高氮時Orn途徑占據(jù)主導(dǎo)地位［15，39?40］。本試驗結(jié)果可能是發(fā)草地上部分氮素水平較高，水分脅迫時間（35 d）過長，所以激活了地上部分Orn 途徑，但具體參與調(diào)控的機制有待進一步研究。

4 結(jié)論

干旱到水澇的系列水分脅迫下，發(fā)草通過提高其Pro 含量來緩解滲透脅迫造成的傷害。發(fā)草植株內(nèi)Pro 含量的升高是主動積累的過程，地上部分與根系積累的Pro 含量差不多。地上部分Pro 積累是Glu 途徑和Orn 途徑共同作用的結(jié)果，但根系中以Glu 途徑為主。