黃 越，陳乃耀，趙 輝，閆振宇，張海霞，趙雪聰，張丁平

(1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院血液內(nèi)科，河北 唐山 063000；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134)

隨著顱腦腫瘤的發(fā)病率逐漸升高，顱腦放射治療已成為顱內(nèi)原發(fā)和繼發(fā)腫瘤的主要治療手段[1]。但輻射會損傷周圍健康的腦組織，產(chǎn)生輻射相關(guān)的認(rèn)知功能障礙[2]。目前對于導(dǎo)致輻射相關(guān)的認(rèn)知功能障礙的病理生理學(xué)仍缺乏深入的了解，也缺乏行之有效的預(yù)防和治療措施。研究發(fā)現(xiàn)，輻射相關(guān)認(rèn)知功能障礙與海馬區(qū)神經(jīng)元的丟失、減少新生神經(jīng)元的產(chǎn)生關(guān)系密切[3]。其中輻射導(dǎo)致的活性氧的過量積聚和神經(jīng)炎癥是神經(jīng)元丟失的重要原因[4]。電離輻射可直接與關(guān)鍵的有機(jī)生物分子相互作用產(chǎn)生自由基；也可間接通過分解細(xì)胞內(nèi)的水產(chǎn)生活性氧(ROS，電離的間接效應(yīng))，如H2O2、O2-·和·OH[5]。這些過度生成的ROS不僅會破壞DNA的含氮堿基、嘌呤、嘧啶和脫氧核糖骨架，還會損傷線粒體DNA、蛋白質(zhì)/酶和膜，使線粒體中ATP生成障礙，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[6]。了解顱腦照射對神經(jīng)元細(xì)胞的影響及分子機(jī)制，可能為改善臨床暴露于電離輻射后認(rèn)知障礙的防治策略提供重要線索。HT22細(xì)胞是一種永生化的小鼠海馬脊髓細(xì)胞系，與未分化的神經(jīng)干細(xì)胞相似并表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶和神經(jīng)絲蛋白，已被廣泛用作中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的體外模型[7]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用直線加速器放射治療機(jī)照射HT22細(xì)胞，應(yīng)用N-乙酰半胱氨酸干預(yù)，觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧及其代謝產(chǎn)物的變化，以及對HT22細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期探討放射性腦損傷的發(fā)生機(jī)制，并為放射性腦損傷防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞購自上海賽百康生物技術(shù)有限公司；直線加速器放射治療機(jī)(美國VARIAN公司)由華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院放療科提供；胎牛血清購自PAN；0.25%EDTA-胰酶購自美國Gibico公司；抗青霉素/鏈霉素溶液、DMEM高糖培養(yǎng)基均購自CORNING公司；抗氧化劑NAC購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；FITC Annexin V Apoptisis Detection Kit購自美國BD公司；GSH、SOD、MDA試劑盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司；冰醋酸購自天津化學(xué)試劑公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自ZOMANBIO；BCA法蛋白定量試劑盒購自MultiSciences公司；BSA購自BOVOGEN； DCFH-DA購自Caymar；抗β-actin抗體購自 Abcam公司；抗cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2抗體購自北京博奧森公司；鼠二抗體購自KPL公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1HT22細(xì)胞培養(yǎng)

將HT22細(xì)胞培養(yǎng)在T25培養(yǎng)瓶中，加入含有10%FBS、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%～90%融合時，1∶4傳代。

1.2.2細(xì)胞用藥配制

CCK-8確定NAC的最佳給藥劑量為5 mmol/L。稱取1.35 g NAC，溶于超純水配成1 mol/L的儲存液，并通過0.22 μm膜過濾除去細(xì)菌，使用前用DMEM高糖完全培養(yǎng)基配成5 mmol/L的工作液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞輻射模型的建立及輻射劑量范圍的確定

1.2.4實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分組為：①空白對照組(Control)：加入完全培養(yǎng)基，不給予照射；②單純輻射組(RT)：加入完全培養(yǎng)基，給予10 Gy X射線照射；③輻射+NAC組(RT+NAC)：用NAC預(yù)先處理HT22細(xì)胞1.5 h后加入完全培養(yǎng)基，再給予10 Gy X射線照射。

1.2.5HT22細(xì)胞形態(tài)變化觀察

細(xì)胞接種T12.5培養(yǎng)瓶后，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%時，按分組給予不同刺激，24 h后用倒置顯微鏡觀察并隨機(jī)拍攝5個視野，記錄細(xì)胞數(shù)量及生長形態(tài)變化。

1.2.6CCK-8法檢測HT22細(xì)胞增殖

細(xì)胞接種于96孔板后，培養(yǎng)24小時后按分組給予不同刺激，CCK-8法檢測HT22細(xì)胞的增殖率，每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.7Annexin/PI雙標(biāo)記法檢測HT22細(xì)胞凋亡

布置于彎管側(cè)壁面的貼片(方1～14)損傷形貌特征主要表現(xiàn)為：除了串坑外，砂粒沖擊的坑明顯直徑較小，分布密集,這是因?yàn)閺澒芏螞_蝕和腐蝕并存并交互影響，但又有不同的優(yōu)勢區(qū)。當(dāng)流動攜帶的砂粒與貼片接觸時間較長且法向沖擊速度較小時，管道壁面上容易產(chǎn)生劃痕；當(dāng)接觸時間較短且沖擊應(yīng)力較大時，材料表面上主要產(chǎn)生壓痕。材料大部分的質(zhì)量損失都是條狀劃痕和三角狀壓痕引起的，壓痕和劃痕是砂粒沖蝕的主要破壞形式。結(jié)合彎管流場分析可知，彎管外拱壁處流動在較高壓強(qiáng)和離心力作用下，固相顆粒具有較大的動量，顆粒頻繁、多次沖擊壁面，致使金屬表層材料的剝落十分嚴(yán)重。

細(xì)胞分組及處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用無EDTA胰酶消化，收集細(xì)胞和上清液，用PBS清洗2次；1 000 r/min，離心5 min，棄上清液，加入適量1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度大約為1×106個/mL。加入5 μL Annexin V-FITC避光染色15 min，再加入5 μL PI，室溫、避光孵育5 min；1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。

1.2.8細(xì)胞內(nèi)ROS檢測

細(xì)胞分組及處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入DCFH-DA染液，37 ℃溫箱中孵育30 min，熒光顯微鏡(TE-2000 Nikon，日本)下隨機(jī)拍照記錄5個高倍鏡視野，應(yīng)用圖像分析軟件(Image J 1.47i)軟件計算出綠色熒光強(qiáng)度的平均值，熒光強(qiáng)度可間接反映細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9細(xì)胞內(nèi)GSH、SOD，MDA水平

細(xì)胞分組及處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌2次，超聲破碎細(xì)胞，Bradford法測定蛋白濃度，嚴(yán)格按試劑盒說明書步驟操作，分光光度計檢測細(xì)胞內(nèi)GSH、MDA水平及SOD活性。

1.2.10Western blot法檢測HT22細(xì)胞中促凋亡及抗凋亡蛋白

細(xì)胞分組及處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用預(yù)冷PBS洗滌2次，加入蛋白質(zhì)裂解液裂解，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，回收上清(蛋白質(zhì))，取少量上清液用BCA試劑盒測定蛋白濃度，剩余上清液進(jìn)行蛋白測定。等量上樣，進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上、5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗膜3次，每次10分鐘，然后一抗4 ℃孵育過夜(抗β-actin 1∶50 000稀釋，抗Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2 1∶1 000稀釋)，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光技術(shù)顯影，用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析：測量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，p<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 照射劑量對HT22細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示，給予HT22細(xì)胞不同照射劑量后，CCK-8結(jié)果顯示，2 Gy照射劑量對細(xì)胞增殖無明顯影響，當(dāng)照射劑量大于2 Gy時，隨著照射劑量的增加，HT-22細(xì)胞增殖率呈劑量依賴性降低(p<0.01)，當(dāng)照射劑量為10 Gy時，細(xì)胞增殖率接近50%。

注：**與0 Gy輻射劑量組比較, p<0.01(n=3)。圖1 不同劑量X射線照射對HT-22細(xì)胞增殖活力的影響Fig.1 Effect of different doses of X rayon the viability of HT-22 cells

2.2 RT和NAC對HT22細(xì)胞增殖率的影響

如圖2所示，給予10 Gy X射線照射，分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，CCK-8法檢測HT22細(xì)胞的增殖率。與Control組相比，RT組HT22細(xì)胞增殖率明顯受到抑制(p<0.01)；與RT組相比，RT+NAC組HT22細(xì)胞增殖率明顯增高(p<0.01)。

注：**與Control組相比，p<0.01；##與RT組相比，p<0.01。圖2 RT和NAC對HT22細(xì)胞增殖率的影響Fig.2 Effects of RT and NAC on theproliferation rate of HT22 cells

2.3 RT和NAC對HT22細(xì)胞凋亡的影響

給予10 Gy X射線照射，分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，應(yīng)用Annexin/PI雙標(biāo)記法檢測HT22細(xì)胞凋亡率，結(jié)果示于圖3。由圖3可見，與Control組相比，RT組細(xì)胞凋亡率顯著增加(p<0.01)，與RT組相比，RT+NAC組細(xì)胞凋亡率顯著減少(p<0.01)。

2.4 RT和NAC對HT22細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

細(xì)胞分組及處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入DCFH-DA染液，熒光顯微鏡檢測 DCF 的熒光強(qiáng)度，結(jié)果示于圖4。由圖4可見，與Control組相比，RT組熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(p<0.01)，提示細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平顯著增高；與RT組相比，RT+NAC組熒光強(qiáng)度顯著減弱(p<0.01)，提示細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平降低。

2.5 RT和NAC對HT22細(xì)胞內(nèi)GSH、MDA水平及SOD活性的影響

細(xì)胞分組及處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分光光度計檢測細(xì)胞內(nèi)GSH、SOD、MDA水平，結(jié)果示于圖5。由圖5可見，與Control組相比，RT組細(xì)胞內(nèi)MDA顯著增加(p<0.01)，GSH水平及SOD活性顯著降低(p<0.01)。與RT組相比，RT+NAC組細(xì)胞內(nèi)MDA顯著減少(p<0.01)，GSH水平及SOD活性顯著增強(qiáng)(p<0.01)。

注：**與Control組相比，p<0.01；##與RT組相比，p<0.01。圖3 RT和NAC對HT22細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effects of RT and NAC on apoptosis of HT22 cells

圖4(A) RT和NAC對HT22細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度的影響(200×)Fig.4(A) Effects of RT and NAC on thefluorescence intensity of ROS in HT22 cells

注：**與Control組相比，p<0.01；##與RT組相比，p<0.01。圖4(B) ROS熒光強(qiáng)度定量分析Fig.4(B) Quantitative analysis of ROSfluorescence intensity

2.6 RT和NAC對HT22細(xì)胞內(nèi)促凋亡及抗凋亡蛋白的影響

結(jié)果示于圖6。由圖6可見，Western blot結(jié)果顯示與Control組相比，RT組細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白Cleaved-caspase-3及Bax/Bcl-2顯著增加(p<0.01)。與RT組相比，RT+NAC組細(xì)胞內(nèi)Cleaved-caspase-3及Bax/Bcl-2顯著減少(p<0.01)，但仍比對照組高近一倍。

3 討論

注：**與Control組相比，p<0.01；##與RT組相比，p<0.01。圖5 RT和NAC對HT22細(xì)胞內(nèi)GSH、MDA、SOD水平的影響Fig.5 Effects of RT and NAC on the levels of GSH, MDA and SOD in HT22 cells

注：**與Control組相比，p<0.01；##與RT組相比，p<0.01。圖6 RT和NAC對HT22細(xì)胞內(nèi)蛋白含量的影響Fig.6 Effect of RT and NAC on protein content in HT22 cells

眾所周知，海馬區(qū)在學(xué)習(xí)和記憶中扮演著重要角色。全腦放療過程中海馬神經(jīng)干細(xì)胞損傷是記憶衰退的核心，海馬適形回避與記憶保存有關(guān)[8]。在成年哺乳動物大腦中，海馬齒狀回的顆粒下區(qū)(subgranular zone, SGZ)的神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells, NSCs)可以在不同的刺激下分化產(chǎn)生新的神經(jīng)元[9]。神經(jīng)祖細(xì)胞/干細(xì)胞經(jīng)歷增殖、分化、遷移和成熟的過程通常被認(rèn)為是神經(jīng)發(fā)生的過程。這一過程對氧化應(yīng)激極為敏感，氧化應(yīng)激和神經(jīng)原性微環(huán)境中氧化還原平衡的持續(xù)改變被認(rèn)為是輻射介導(dǎo)的海馬神經(jīng)發(fā)生變化的重要原因[3]。盡管導(dǎo)致輻射誘導(dǎo)的腦損傷細(xì)胞和分子機(jī)制尚不清楚，但一般認(rèn)為，放療所致的神經(jīng)元發(fā)生減少、丟失過多以及存活神經(jīng)元細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的變化是導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙主要原因。電離輻射可引發(fā)增殖神經(jīng)元細(xì)胞(主要是激活神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞)的凋亡，導(dǎo)致新生神經(jīng)元發(fā)生減少[10-11]；也可導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞微環(huán)境的炎癥和血管損傷抑制神經(jīng)元細(xì)胞的增殖與再生[12]。研究發(fā)現(xiàn)，電離輻射以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)海馬區(qū)和室下區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞的丟失，與細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生密切相關(guān)[13]。即使是低劑量的輻射也會導(dǎo)致氧化應(yīng)激的持續(xù)升高和海馬神經(jīng)發(fā)生持續(xù)抑制。許多硫醇抗氧化劑曾被用作放射防護(hù)劑，但由于其毒性而受到限制。NAC作為一種具有抗氧化特性、耐受性好、安全的非處方藥物，已在世界各地廣泛使用。研究表明，NAC可能參與調(diào)節(jié)多種精神和神經(jīng)疾病的病理生理過程，包括氧化應(yīng)激、神經(jīng)發(fā)生和細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙、神經(jīng)炎癥等[14]。我們用HT22細(xì)胞建立輻射損傷的細(xì)胞模型，應(yīng)用NAC進(jìn)行干預(yù)，觀察輻射后細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激變化情況，以及對HT22細(xì)胞增殖和凋亡的影響，旨在探討放射性神經(jīng)元損傷的發(fā)生機(jī)制，為放射性腦損傷的防治提供新的思路。

越來越多的證據(jù)表明，ROS、GSH、SOD、MDA與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[15]。與其他器官相比，大腦具有更高水平的不飽和脂肪酸并需要消耗更多氧氣進(jìn)行代謝[16]。受到損傷后大腦內(nèi)氧氣消耗增加可能會促進(jìn)超氧陰離子的產(chǎn)生，并引發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)，形成H2O2和OH-，從而導(dǎo)致ROS形成[17]。NAC作為半胱氨酸的前體，進(jìn)入細(xì)胞后直接與ROS發(fā)生親核反應(yīng)，以清除ROS。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，NAC可直接清除H2O2、羥基自由基和次氯酸[18]。增加的ROS攻擊細(xì)胞分子如膜脂、蛋白質(zhì)和核DNA，與多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成脂質(zhì)過氧化物MDA，導(dǎo)致膜不穩(wěn)定和脂質(zhì)過氧化。因此細(xì)胞內(nèi)MDA的含量變化常常能反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細(xì)胞受損的程度[19]。NAC可以保護(hù)細(xì)胞膜免受脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化，并有助于維持細(xì)胞器的完整性[20-21]。因此，NAC可減少細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA的積聚，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

NAC也可通過酶促防御系統(tǒng)(SOD)或非酶系統(tǒng)(GSH)抵抗氧化應(yīng)激的損傷[22-23]。NAC既是GSH的類似物又是細(xì)胞內(nèi)合成GSH的前體，具有恢復(fù)細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的特性，在保護(hù)細(xì)胞免受輻射誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用[18]。體外和體內(nèi)研究均表明，NAC不僅能夠通過將細(xì)胞外胱氨酸還原為半胱氨酸來補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)GSH[24]，還可以通過補(bǔ)充巰基(—SH)基團(tuán)刺激GSH合成并提高谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性[25]。NAC進(jìn)入細(xì)胞后促進(jìn)GSH的產(chǎn)生，GSH可直接清除ROS，減少H202的生成[26]。β-谷氨酸-半胱氨酸連接酶是細(xì)胞內(nèi)GSH生物合成中產(chǎn)生谷氨酰半胱氨酸的限速酶，Ozaras等證明，NAC通過提高細(xì)胞內(nèi)β-谷氨酸-半胱氨酸連接酶活性、升高GSH保護(hù)肝臟免受氧化應(yīng)激損傷[27]。因此，在本研究中輻射暴露后由于GSH參與了ROS的消除，所以GSH快速消耗。而NAC治療可逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激過程中GSH的耗竭和自由基的形成[28]。此外，SOD也是一種重要的抗氧化酶，電離輻射和許多氧化還原化學(xué)物可在短時間內(nèi)使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的O2·-，O2·-的過量產(chǎn)生可導(dǎo)致廣泛的擴(kuò)散損傷[29]。SOD可將O2·-分解為H20和氧分子，是抵抗細(xì)胞和組織中O2·-的第一道防線，也被認(rèn)為是防止由ROS和脂質(zhì)過氧化引起損傷的主要防線[30]。NAC處理可提高細(xì)胞內(nèi)SOD的活性，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力[23]。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

細(xì)胞凋亡是一種“程序性細(xì)胞死亡”，Bcl-2 家族是調(diào)控凋亡的重要基因家族，主要參與線粒體途徑介導(dǎo)的凋亡[31]。其中促凋亡蛋白 Bax與抗凋亡蛋白 Bcl-2 的比例是決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的重要因素[32]。當(dāng)Bax/Bcl-2比例增高時，促進(jìn)細(xì)胞色素C(cytochrome C, Cyt-C)的釋放和半胱天冬酶的激活[33]。半胱天冬酶是參與凋亡的最重要的酶，其水解細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)和功能蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。半胱天冬酶在細(xì)胞中為無活性的酶原，需要被激活才能發(fā)揮作用。當(dāng)受到輻射后，細(xì)胞內(nèi)ROS過量積聚，ROS的產(chǎn)生也被證明可以釋放Cyt-C，激活caspase級聯(lián)通路，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[34-35]。Mansour等發(fā)現(xiàn)，輻射暴露后HepG2細(xì)胞內(nèi)MDA水平的顯著增加且伴隨caspase-3的激活[36]。Li等表明[37]，輻射引起大鼠海馬組織損傷是通過ROS的產(chǎn)生來介導(dǎo)的，表現(xiàn)為caspase-3水平升高，均證明氧化應(yīng)激在輻射誘導(dǎo)的組織損傷中的作用。而NAC可通過阻止caspase-3的活化，阻止細(xì)胞凋亡的下游信號傳導(dǎo)[38]。在本實(shí)驗(yàn)中NAC預(yù)處理通過阻止caspase-3的活化，減少輻射誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，NAC可通過抑制輻射后神經(jīng)元細(xì)胞的氧化應(yīng)激減少細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白的含量，從而減少細(xì)胞凋亡。因此NAC可能是未來治療輻射相關(guān)認(rèn)知功能障礙的潛在治療手段。