楊清雅， 周麗， 李靜， 楊萍， 潘潔瑢

小兒膽道閉鎖(Biliary atresia,BA)是一種肝內(nèi)外膽管出現(xiàn)阻塞，并可導(dǎo)致肝硬化甚至肝衰竭的先天性疾病[1],葛西手術(shù)(Kasai portoenterostomy,KPE)是目前公認(rèn)的首選治療方法[2],然而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，即使接受KPE的患兒術(shù)后仍會出現(xiàn)進(jìn)行性肝纖維化，這導(dǎo)致患兒的自體肝生存率(native liver survival,NLS)(即患兒術(shù)后一段時(shí)間內(nèi)以自身肝臟存活的概率)降低以及長期預(yù)后不良[3]，其原因是因?yàn)殡m然手術(shù)能夠重建肝外膽道、改善膽汁淤積的情況，但免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)仍持續(xù)存在，因此患兒術(shù)后仍會出現(xiàn)肝纖維化[4,5]。雖然肝活檢是肝纖維化診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但KPE后需要對肝纖維化進(jìn)程進(jìn)行長期、頻繁的監(jiān)測，所以并不作為KPE后的常規(guī)檢測方法。超聲剪切波彈性成像(shear wave elastography,SWE)已經(jīng)用于BA的診斷以及術(shù)后監(jiān)測[6]。現(xiàn)已證明肝臟彈性測量值(liver stiffness measurement,LSM)與肝纖維化的組織學(xué)分期密切相關(guān)[7-9]。已有研究將SWE納入KPE術(shù)后隨訪的常規(guī)檢查并證明LSM可以準(zhǔn)確評估肝纖維化程度[10]，但鮮有研究關(guān)注BA患兒KPE預(yù)后的預(yù)測以采取更多預(yù)防性措施來減少患兒的并發(fā)癥或盡早進(jìn)行肝移植。本研究利用LSM聯(lián)合臨床常用指標(biāo)建立列線圖預(yù)測模型，以個體化評估BA患兒在接受KPE后的預(yù)后情況，為臨床針對BA的治療提供參考。

材料與方法

1.研究對象

選擇2012年12月-2017年12月經(jīng)腹腔鏡探查確診為BA并接受KPE的患兒作為研究對象。排除KPE后3個月內(nèi)不能存活的患兒(3例)、合并乙肝或丙肝的患兒(1例)以及有肝失代償史的患兒(1例)。本研究共納入BA患兒102例，其中男46例，女56例，手術(shù)時(shí)日齡14～148d，平均(60±34)d；其中II型BA10例(9.8%)，III型BA92例(90.2%)。所有患者家屬均知情同意，本研究得到我院倫理委員會批準(zhǔn)。

2.研究方法

血常規(guī)以及血清生化指標(biāo)測定：抽取空腹肘靜脈血8 mL，其中2 mL使用XN-9000全自動血液細(xì)胞分析儀自動生成血常規(guī)數(shù)據(jù)。2 mL靜脈血使用CS-5100全自動血凝儀檢測凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)，并計(jì)算國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio，INR)。另取4ml靜脈血，4℃、10000 rpm離心5 min取上清用于檢測生化指標(biāo)，采用西門子ADVIA Centaur CP全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀以及配套試劑檢測總膽紅素(total bilirubin，TB)、直接膽紅素(direct bilirubin，DB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶(glutamyl transpeptidase， GGT)、白蛋白等生化指標(biāo)水平。檢測流程嚴(yán)格按照儀器及試劑盒說明書。

SWE檢查：采用Aixplorer新聲威超聲診斷儀，14L5線陣探頭(頻率5～14 MHz)，患兒取仰臥位，充分暴露上腹部，在安靜、呼吸平緩狀態(tài)下進(jìn)行檢查。在常規(guī)腹部檢查后啟動SWE程序(圖1)，采樣框置于右肝前葉下段距肝包膜約1 cm處，避開膽囊及血管，在采樣框中設(shè)置直徑10 mm的圓形感興趣區(qū)(ROI)，當(dāng)大部分ROI(>90%)被均勻的顏色填充時(shí)采集圖像，記錄5次有效測量值后取中位數(shù)作為LSM值。

圖1 BA患兒的SWE圖像。 SWE圖像中上半部分為彩色的彈性分布圖，下半部分為灰度圖像。a) 患兒預(yù)后較好，3年內(nèi)未進(jìn)展為肝硬化，ROI中的LSM值為11.5 kPa; b) 患兒在第3年接受肝移植，LSM為16.0 kPa。

研究方案：所有患兒由經(jīng)驗(yàn)豐富的手術(shù)團(tuán)隊(duì)進(jìn)行KPE，于術(shù)中取肝右葉下緣的肝組織行病理檢查，并使用METAVIR評分(F0-F4)進(jìn)行分級。術(shù)后常規(guī)進(jìn)行抗感染、利膽、護(hù)肝、靜脈營養(yǎng)等治療。記錄術(shù)后3個月的TB、DB、ALT、AST、GGT等血清學(xué)指標(biāo)、LSM值、有無膽管炎發(fā)作以及黃疸消退情況作為建立列線圖的潛在指標(biāo)并定期隨訪。

隨訪：采用門診復(fù)查、電話等方式進(jìn)行術(shù)后隨訪，術(shù)后每月復(fù)查1次，3個月后病情穩(wěn)定改為每3個月復(fù)查一次，共隨訪3年。隨訪內(nèi)容包括體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查及超聲檢查等，記錄患兒生長發(fā)育情況，以患兒肝移植或死亡作為隨訪終點(diǎn)。

列線圖設(shè)計(jì)：通過隨機(jī)數(shù)字表法分配得到訓(xùn)練隊(duì)列68例與獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列34例。在訓(xùn)練隊(duì)列中，通過計(jì)算NLS，篩選影響B(tài)A患兒NLS的指標(biāo)，利用多因素分析確定影響B(tài)A患兒預(yù)后的獨(dú)立因素，并以此建立列線圖來估計(jì)BA患兒1、2、3年的NLS。列線圖在訓(xùn)練隊(duì)列中進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，在驗(yàn)證隊(duì)列中進(jìn)行外部驗(yàn)證。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料通過X-Tile軟件轉(zhuǎn)化為分類變量[11]。計(jì)數(shù)資料應(yīng)用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，等級資料應(yīng)用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。采用Medclac22.0.4進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析繪制生存曲線。采用Logrank法進(jìn)行單因素預(yù)后分析，其中P<0.05的變量納入Cox多因素比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行預(yù)后分析。利用SPSS 19.0軟件分析Cox回歸的結(jié)果，并使用R4.0.2軟件中的rms包構(gòu)建列線圖模型。利用Bootstrap重采樣(1000次)分析得到模型性能的相對無偏差估計(jì)。利用受試者工作特性曲線下面積(area under curve,AUC)評價(jià)列線圖的區(qū)分度，利用校準(zhǔn)曲線和Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)評價(jià)列線圖的校準(zhǔn)度。

結(jié) 果

1.隨訪結(jié)果

訓(xùn)練隊(duì)列與驗(yàn)證隊(duì)列的各項(xiàng)特征見表1。訓(xùn)練隊(duì)列BA患兒1、2、3年的NLS(82.5%、66.2%、47.1%)與驗(yàn)證隊(duì)列(82.4%、67.8%、50.0%)近似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05，圖2)。兩個隊(duì)列間各項(xiàng)指標(biāo)均近似，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均>0.05)。

圖2 訓(xùn)練隊(duì)列與驗(yàn)證隊(duì)列BA患兒KPE后的NLS情況(Kaplan-Meier法)。

表1 訓(xùn)練隊(duì)列與驗(yàn)證隊(duì)列BA患兒的臨床資料比較 (n,%)

2.影響B(tài)A患兒預(yù)后的潛在指標(biāo)分析

單因素分析結(jié)果顯示，較高的手術(shù)時(shí)日齡、METAVIR評分、AST、白蛋白、TB、GGT、LSM、INR、膽管炎以及黃疸未消退與NLS縮短相關(guān)(P值均<0.05，圖3、表2)。多因素分析結(jié)果顯示，手術(shù)時(shí)日齡、METAVIR評分、LSM、出現(xiàn)膽管炎以及黃疸未消退是影響B(tài)A患兒術(shù)后NLS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表3)。

圖3 不同指標(biāo)對BA患兒KPE后NLS的影響(Kaplan-Meier法)。

表2 不同指標(biāo)對BA患兒NLS的影響因素分析 (n,%)

表3 影響B(tài)A患兒NLS的獨(dú)立影響因素分析

3.預(yù)測BA患兒預(yù)后的列線圖模型

基于多因素分析結(jié)果建立用于預(yù)測BA患兒預(yù)后的列線圖(圖4)。手術(shù)時(shí)日齡、METAVIR評分、LSM、出現(xiàn)膽管炎以及黃疸未消退在列線圖中根據(jù)自身的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)進(jìn)行了分布。每位BA患兒根據(jù)各自情況在各項(xiàng)因素對應(yīng)的軸上找到對應(yīng)的點(diǎn)，通過累積各點(diǎn)對應(yīng)的分?jǐn)?shù)即可計(jì)算總分，從而評估該BA患兒1、2、3年NLS的概率。

圖4 列線圖預(yù)測BA患兒1、2、3年的NLS。

4.列線圖的效能評估及驗(yàn)證

在訓(xùn)練隊(duì)列中，列線圖預(yù)測1、2、3年NLS的AUC(AUC分別為0.861、0.841、0.836)與驗(yàn)證隊(duì)列(AUC分別為0.815、0.780、0.786)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。校準(zhǔn)曲線圖顯示，內(nèi)部驗(yàn)證和外部的列線圖預(yù)測BA患兒1、2和3年NLS與實(shí)際觀察值大致一致(圖5)，Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)提示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(內(nèi)部驗(yàn)證：1年NLS：χ2=6.438，P=0.598，2年NLS：χ2=8.170，P=0.417，3年NLS：χ2=11.213，P=0.190；外部驗(yàn)證：1年NLS：χ2=5.344，P=0.876，2年NLS：χ2=7.860，P=0.672，3年NLS：χ2=9.881，P=0.231)。

圖5 列線圖的區(qū)分度及校準(zhǔn)度分析。a～c) 區(qū)分度分析，綠色曲線為基于訓(xùn)練隊(duì)列的內(nèi)部驗(yàn)證，藍(lán)色曲線為基于驗(yàn)證隊(duì)列的外部驗(yàn)證；d～f) 校準(zhǔn)度分析，藍(lán)色曲線為內(nèi)部驗(yàn)證，黑色曲線為外部驗(yàn)證。

討 論

早期預(yù)測KPE術(shù)后的不良預(yù)后有助于在BA患兒出現(xiàn)明顯肝硬化等潛在并發(fā)癥之前進(jìn)行預(yù)防性治療并及早考慮肝移植。2018版《膽道閉鎖診斷及治療指南》中指出，膽道閉鎖類型、手術(shù)時(shí)間晚、術(shù)后反復(fù)發(fā)作膽管炎以及肝纖維化程度與BA不良預(yù)后密切相關(guān)[12]。但上述均為定性指標(biāo)，無法用于預(yù)測BA患兒的NLS。ALT、AST、GGT等反映肝功能的常規(guī)生化指標(biāo)特異性較差，易受患兒本身的年齡以及肝外感染等因素影響，也無法準(zhǔn)確評估BA患兒的肝功能情況[13]。SWE對肝纖維化具有較高的診斷敏感度和特異度，通過測量LSM值可以無創(chuàng)、客觀地定量評估肝纖維化進(jìn)展的程度。本研究采用SWE測量LSM值評價(jià)BA患兒肝纖維化程度，并結(jié)合手術(shù)時(shí)日齡、METAVIR評分、是否出現(xiàn)膽管炎以及黃疸消退，建立列線圖用于預(yù)測BA患兒KPE后3年內(nèi)的NLS，以及早對可能出現(xiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥進(jìn)行預(yù)防，改善BA患兒的預(yù)后。

之所以選擇KPE術(shù)后3個月時(shí)檢測的指標(biāo)作為潛在的預(yù)測因素，是因?yàn)樾g(shù)后早期肝臟剛經(jīng)歷過手術(shù)創(chuàng)傷，肝細(xì)胞處于高度水腫和炎癥狀態(tài)，此時(shí)肝功能的各項(xiàng)生化指標(biāo)及LSM值會暫時(shí)升高，所以并不能真實(shí)反映患兒KPE后的恢復(fù)情況。經(jīng)過2～3個月的恢復(fù)期后，各項(xiàng)指標(biāo)會逐漸趨于平穩(wěn)。因此相比于術(shù)后早期檢測，此時(shí)更能準(zhǔn)確反映BA患兒的恢復(fù)情況[10]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，BA患兒反映肝功能的指標(biāo)多在術(shù)后2～3個月達(dá)到高峰，若在3個月時(shí)反映肝功能的各項(xiàng)指標(biāo)仍處于較高水平，則提示患兒可能受到持續(xù)性膽汁淤積的影響[14]。因此，筆者認(rèn)為術(shù)后3個月時(shí)檢測患兒的各項(xiàng)指標(biāo)對臨床防治肝纖維化及其并發(fā)癥有積極的指導(dǎo)意義。

BA患兒的NLS依賴于KPE后良好的預(yù)后[15,16]。手術(shù)時(shí)日齡、肝功能以及肝臟病變程度是目前已知影響B(tài)A患兒預(yù)后的主要因素[10,17-19]。本研究結(jié)果顯示，較大的手術(shù)日齡、METAVIR評分、KPE后3個月時(shí)高LSM、膽管炎以及黃疸是BA患兒預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。LSM被廣泛用于肝纖維化的臨床診斷和監(jiān)測[20]。本研究結(jié)果表明，術(shù)后3個月時(shí)的LSM對BA患兒KPE后的NLS有很好的預(yù)測價(jià)值。KPE后3個月時(shí)，LSM值小于8.9 kPa的患兒術(shù)后1、2、3年NLS顯著好于8.9～15.9 kPa以及高于15.9 kPa的患兒。已有研究將LSM納入KPE后常規(guī)檢測指標(biāo)，用于監(jiān)測KPE后BA進(jìn)展性肝纖維化相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生[21,22]。LSM值升高往往提示BA患兒肝纖維化程度嚴(yán)重，易發(fā)生食管、胃底靜脈曲張等并發(fā)癥，長期隨訪預(yù)后較差[18]。然而，LSM值特異性較差，易受患兒自身因素影響，其獨(dú)立預(yù)測BA患兒KPE后的NLS準(zhǔn)確性有限[19]。盡管多因素分析結(jié)果提示LSM是影響B(tài)A患兒預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但仍不足以獨(dú)立預(yù)測3年內(nèi)NLS。

本研究結(jié)果顯示，基于LSM聯(lián)合常規(guī)臨床指標(biāo)建立的列線圖可以較準(zhǔn)確地預(yù)測BA患兒KPE后3年內(nèi)的NLS,預(yù)測準(zhǔn)確度略高于Wang等[22]的列線圖，其預(yù)測BA患兒KPE術(shù)后NLS的AUC為0.780;這可能是因?yàn)閃ang等的研究是基于術(shù)前患兒的肝功能狀況進(jìn)行的預(yù)測，而術(shù)后的膽汁淤積改善程度以及患兒自身的恢復(fù)情況對KPE術(shù)后肝纖維化的進(jìn)展速度影響更大，因此我們建立的列線圖的預(yù)測準(zhǔn)確性更高。此外，本研究納入的指標(biāo)更易獲取，臨床醫(yī)生可根據(jù)BA患兒的手術(shù)時(shí)日齡、術(shù)中METAVIR評分以及術(shù)后3個月隨訪時(shí)的LSM、膽管炎及黃疸消退情況，計(jì)算每位患兒KPE后前3年的NLS概率。例如當(dāng)1位BA患兒在出生后67天接受KPE，術(shù)中肝臟組織活檢METAVIR評分為F3，術(shù)后3個月內(nèi)黃疸仍未消除且反復(fù)出現(xiàn)膽管炎，復(fù)查LSM值為12.8 kPa，則列線圖的總分約為170，提示該患兒1、2、3年NLS分別為85%、75%、65%。這有助于臨床醫(yī)生及時(shí)調(diào)整治療方案，避免或減少BA患兒不良預(yù)后的發(fā)生。

雖然本研究對列線圖進(jìn)行了內(nèi)部和外部驗(yàn)證，但樣本量仍然有限，其結(jié)果可能存在偏倚;且多數(shù)患兒BA分型為III型，僅少量II型患兒，不能準(zhǔn)確反映BA分型對于KPE術(shù)后預(yù)后的影響。本研究后續(xù)計(jì)劃擴(kuò)大樣本量對列線圖的準(zhǔn)確性和可靠性進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，以期用更詳細(xì)的數(shù)據(jù)來完善研究結(jié)論。

綜上所述，基于SWE聯(lián)合常見臨床指標(biāo)建立的列線圖模型有望準(zhǔn)確評估BA患兒術(shù)后3年內(nèi)的NLS,可為臨床基于患兒個體情況準(zhǔn)確預(yù)測NLS提供理論依據(jù)。