汪德兵， 楊鵬， 黃智， 許敏， 王黎洲， 周石

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床常見惡性腫瘤，目前，隨著診療技術(shù)進(jìn)步，HCC早期檢出率有所提高[1]，但有關(guān)HCC的發(fā)病機(jī)制仍尚未完全闡明，且多數(shù)患者確診時(shí)肝臟儲(chǔ)備功能降低，全身狀態(tài)惡化，失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)[2]。因而，探索HCC早期病理特點(diǎn)對HCC治療具有重要意義。而HCC建模是開展HCC基礎(chǔ)研究的必然選擇，兔VX2肝癌模型被認(rèn)為與人類HCC病理特征相近[3]，而超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺植瘤是目前臨床常用HCC動(dòng)物建模方法，但近年來有學(xué)者對其建模成瘤率和臨床應(yīng)用提出異議[4-5]。筆者對超聲引導(dǎo)下肝癌模型建立的方法進(jìn)行改良，對比分析兩種建模方式的效果，報(bào)道如下。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、設(shè)備及試劑

選擇40只清潔級新西蘭白兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，另取1只荷瘤兔用于VX2肝癌腫瘤組織塊懸液備制。白兔均由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，要求白兔體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄不限。戊巴比妥鈉粉劑購自中國醫(yī)藥集團(tuán)，生產(chǎn)批號(hào)F20081216。戊巴比妥鈉采用0.9%生理鹽水配成3.0%溶液后使用。速眠新購自長沙拜特生物科技研究所有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：獸藥字180121777。超聲診斷儀為Philips HD7型飛利浦彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)。數(shù)字減影血管造影(digital subtraction angiography,DSA)采用日本東芝公司生產(chǎn)的INFFX 8000V型800毫安以上DSA造影機(jī)。

2.實(shí)驗(yàn)步驟

觀察組實(shí)驗(yàn)步驟 ：①VX2腫瘤組織塊懸液備制：對VX2荷瘤兔稱重，一側(cè)后腿肌注3%戊巴比妥鈉1 mL/kg，另一側(cè)肌注速眠新0.2 mL/kg。麻醉起效后，逐層剝離荷瘤兔后腿組織，暴露并切除腫瘤組織，洗凈后置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，縱行切開腫瘤組織，用無菌剪刀將腫瘤標(biāo)本剪成0.5 mm3瘤粒，按1:1比例將瘤粒與無菌生理鹽水混勻，獲得腫瘤組織懸液備用。②肝癌模型建立：取20只實(shí)驗(yàn)白兔，麻醉方法同VX2荷瘤兔，麻醉起效后，將白兔固定于實(shí)驗(yàn)板上，鋪無菌巾，行肝臟超聲掃描。在超聲引導(dǎo)下，采用18G穿刺套管針在肝左葉內(nèi)側(cè)段膈面與外側(cè)段臟面重疊處經(jīng)皮進(jìn)行肝臟穿刺，穿刺針穿入肝臟深度0.8～1.0 cm，在進(jìn)針距體表1.5～2.0 cm，回吸無膽汁及血液后，退出針芯，留置穿刺鞘管，在超聲引導(dǎo)監(jiān)視下，經(jīng)穿刺鞘管將0.3 mL肝癌腫瘤組織懸液緩慢注入肝組織內(nèi)。完成后將明膠海綿條裝于18G血管鞘前端，鞘管尾端接上頭端裝有凝膠海綿條的另一個(gè)穿刺鞘管，采用平頭穿刺針芯將明膠海綿條推入前一個(gè)鞘管，取下尾端鞘管及針芯，再用平頭針芯將明膠海綿條緩慢推入穿刺針道內(nèi)(圖1)，壓迫止血30 s后放回動(dòng)物箱內(nèi)。③超聲監(jiān)測：在建模術(shù)后每周行1次超聲檢查，檢查時(shí)選擇線陣探頭，頻率8.0～12.0 MHz，行彩色多普勒超聲檢查，記錄肝臟超聲回聲特點(diǎn)、腫瘤大小、形態(tài)。待腫瘤直徑生長至2.5 cm時(shí)行DSA檢查，全麻后將動(dòng)物仰臥位固定，在右側(cè)股動(dòng)脈搏動(dòng)最明顯處做切口，暴露股動(dòng)脈并結(jié)扎動(dòng)脈遠(yuǎn)端，透視下配合Progreat微導(dǎo)絲將微導(dǎo)管經(jīng)腹腔干引至肝總動(dòng)脈，注入碘海醇造影劑1 mL行DSA檢查，記錄造影結(jié)果。術(shù)后結(jié)扎股動(dòng)脈近端，縫扎切口。

圖1 a) 超聲引導(dǎo)下將0.3 mL腫瘤組織懸液經(jīng)穿刺鞘管緩慢推入肝臟內(nèi)；b)采用18G穿刺套管針穿刺，明膠海綿條裝于18G血管鞘前段，明膠海綿進(jìn)入穿刺針道后膨脹。 圖2 尸檢取出肝臟標(biāo)本，見團(tuán)塊狀瘤體，肝內(nèi)種植成功。 圖3 尸檢取出肝臟標(biāo)本，見肝周及網(wǎng)膜廣泛結(jié)節(jié)灶，為腫瘤異位種植。

對照組實(shí)驗(yàn)步驟：對實(shí)驗(yàn)白兔行后腿肌注戊巴比妥鈉2 mL/kg麻醉，麻醉起效后行超聲檢查，在超聲引導(dǎo)監(jiān)視下將0.3 mL VX2腫瘤組織懸液緩慢注入肝組織內(nèi)。完成后退針，局部壓迫止血30 s后放回動(dòng)物箱內(nèi)。建模術(shù)后每周行1次超聲監(jiān)測。兩組均在建模術(shù)后正常喂養(yǎng)60 d，記錄白兔死亡時(shí)間，喂養(yǎng)滿60 d后處死白兔，并進(jìn)行尸檢，取肝臟病灶組織進(jìn)行病理檢測。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1.兩組建模手術(shù)情況比較

觀察組建模術(shù)中麻醉誘導(dǎo)時(shí)間較對照組顯著縮短，術(shù)中白兔蘇醒率顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組手術(shù)時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 兩組建模術(shù)中情況比較

2.兩組腫瘤種植結(jié)果

觀察組白兔術(shù)中無死亡，對照組有2只死亡，均因術(shù)中麻醉蘇醒未及時(shí)處理死亡。觀察組術(shù)中死亡率低于對照組，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher檢驗(yàn)，χ2=0.487，P=0.244)。超聲檢查并經(jīng)尸檢結(jié)果證實(shí)，觀察組17只肝內(nèi)種植成瘤，2只肝外腹壁浸潤，1只未發(fā)現(xiàn)瘤體，成瘤率為95%，異位種植率為10%，建模術(shù)后60 d內(nèi)有1只建模成功白兔在術(shù)后第7周時(shí)死亡，存活19只，白兔建模術(shù)后60 d存活率為95%。對照組9只肝內(nèi)種植成功，5只腹壁浸潤，3只腹膜腔種植，1只未發(fā)現(xiàn)瘤體，成瘤率為85%，異位種植率為40%，建模術(shù)后60 d內(nèi)有2只肝癌建模成功白兔在術(shù)后第6周時(shí)死亡，存活16只，存活率為80%。兩組成瘤率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher檢驗(yàn)，χ2=0.605，P=0.302)，兩組白兔建模術(shù)后60 d存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.057，P=0.151)，兩組異位種植率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.800，P=0.028)。腫瘤種植結(jié)果見圖2、3。

3.兩組建模后超聲監(jiān)測結(jié)果

排除建模失敗和建模術(shù)中死亡白兔，觀察組19只和對照組17只建模成功。對建模成功白兔進(jìn)行超聲監(jiān)測，結(jié)果顯示兩組術(shù)后2周、3周及4周時(shí)腫瘤病灶直徑均顯著大于術(shù)后1周，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組術(shù)后2周與術(shù)后3周的腫瘤直徑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后4周觀察組腫瘤直徑顯著大于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。兩組腫瘤病灶被首次超聲檢查發(fā)現(xiàn)時(shí)均以等回聲表現(xiàn)為主，待病灶直徑生長至2.5 cm左右時(shí)行DSA造影多可見“抱球征”(表3，圖4)。在術(shù)后3周時(shí)可發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死，病灶中心無回聲，彩色多普勒超聲檢查提示無血流信號(hào)。肝臟內(nèi)可見結(jié)節(jié)呈稍高回聲、回聲均勻(圖5)。

圖4 肝癌病灶DSA血管造影，可見腫瘤病灶直徑約2.48cm，病灶動(dòng)脈期異常染色、血供豐富，門靜脈期病灶染色減退，瘤體呈“抱球征”。 圖5 肝癌腫瘤超聲表現(xiàn)。a) 肝臟內(nèi)可見結(jié)節(jié)呈稍高回聲、回聲均勻；b) 可見無回聲區(qū)。 圖6 低倍鏡下(×100)觀察肝癌腫瘤細(xì)胞。 圖7 高倍鏡下(×400)觀察肝癌腫瘤細(xì)胞。

表2 兩組成瘤白兔術(shù)后直徑比較 (cm)

表3 兩組成瘤白兔超聲及DSA造影表現(xiàn)特點(diǎn) (n，%)

4.兩組腫瘤病理結(jié)果

白兔死亡后取肝臟病變組織進(jìn)行病理檢查，病理結(jié)果顯示成瘤白兔病變區(qū)域與周圍正常組織邊界欠清晰，可見癌巢樣結(jié)構(gòu)，腫瘤細(xì)胞排列紊亂,形態(tài)各異(圖6、7)。兩組共36只建模成功，腫瘤病理結(jié)果顯示病灶直徑為(3.92±0.41)cm，最后一次超聲檢查結(jié)果顯示腫瘤直徑為(3.93±0.38)cm;超聲與病理結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.068，P=0.946)，兩者具有良好的一致性(r=0.993，P=0.000)。

討 論

建立良好的肝癌動(dòng)物模型是開展基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的必要條件，VX-2腫瘤細(xì)胞株是源于Shope病毒誘發(fā)的兔乳頭狀瘤鱗癌，經(jīng)72次移植傳代后建立的瘤株。移植性VX-2白兔肝癌模型不僅具有與人類相近的組織分型和生物學(xué)行為，還可在肝臟、骨骼、腎臟及軟組織等臟器種植生長，且腫瘤血管生長速度快，血供豐富[6-7]，這也為影像學(xué)研究創(chuàng)造了條件。因而，白兔作為肝癌動(dòng)物模型在臨床得到廣泛應(yīng)用。

經(jīng)皮行肝穿刺與開腹穿刺接種相比，手術(shù)創(chuàng)傷小，術(shù)中死亡率低，重復(fù)性好[8]，本研究結(jié)果也顯示兩組僅對照組發(fā)生2只白兔術(shù)中死亡，與既往報(bào)道一致。本研究利用組織細(xì)胞懸液注入瘤株，可通過細(xì)胞計(jì)數(shù)保證細(xì)胞數(shù)量和濃度的一致性。術(shù)中良好的麻醉方案有助于降低動(dòng)物術(shù)中蘇醒率和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡風(fēng)險(xiǎn)，戊巴比妥鈉通過阻斷腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激活系統(tǒng)，抑制中樞神經(jīng)[9-10]，發(fā)揮鎮(zhèn)靜和抗驚厥作用。本研究選用戊巴比妥鈉，以肌注方式進(jìn)行，這種方式可減緩藥物吸收速率，有助于避免因一過性濃度過高導(dǎo)致白兔死亡[11]。但Kageyama等[12]認(rèn)為單藥麻醉效果有限，既往報(bào)道也顯示單藥麻醉術(shù)中動(dòng)物蘇醒率高，這成為建模術(shù)中重要的死亡原因[13]。本研究中對照組2只白兔均因麻醉意外死亡，與上述報(bào)道一致。速眠新是由ED-TA、DHE-HCL及氟哌啶醇組成的復(fù)方麻醉制劑，具有誘導(dǎo)期短、麻醉起效快等特點(diǎn)[14]。本研究在觀察組中采用戊巴比妥鈉與速眠新復(fù)合麻醉，兩者可發(fā)揮協(xié)同作用，以縮短麻醉誘導(dǎo)時(shí)間，提高麻醉效果。本研究結(jié)果顯示觀察組麻醉誘導(dǎo)時(shí)間較對照組顯著縮短，且術(shù)中蘇醒率顯著降低，說明復(fù)合麻醉較單一麻醉更有助于保證建模術(shù)的安全性。

本研究對建模術(shù)進(jìn)行改良，在注入懸液后封堵穿刺道。本研究根據(jù)明膠海綿遇水膨脹原理[15]，將明膠海綿碾壓呈條狀，讓前一個(gè)含有組織懸液的鞘管與另一個(gè)含明膠海綿條的鞘管頭端完成對接，這可使明膠海綿進(jìn)入穿刺針道后膨脹，從而防止腫瘤組織懸液外滲至肝周或腹腔，降低術(shù)后血腫和異位種植風(fēng)險(xiǎn)。另外，手術(shù)操作也與異位種植相關(guān)。兔肝體積左葉大于右葉，本研究選擇肝左葉內(nèi)側(cè)段膈面與外側(cè)段臟面重疊處作為穿刺點(diǎn)進(jìn)行種植，肝左葉外側(cè)段客觀上起到阻隔作用，有助于防止腹壁和腹腔異位種植。此外，進(jìn)針角度也影響腫瘤懸液細(xì)胞定植。進(jìn)針角度應(yīng)適宜，避免角度太大和進(jìn)針太深，從而有效防止懸液沿針道逆行反流或穿透肝臟[16]，引起腹腔內(nèi)廣泛種植。因而，本研究推薦進(jìn)針時(shí)穿刺針穿入肝臟深度以0.8～1.0 cm為宜。本研究結(jié)果顯示觀察組異位種植率顯著低于對照組，與上述結(jié)論一致。

本研究結(jié)果顯示兩組白兔腫瘤均在術(shù)后2～3周時(shí)迅速生長，直徑達(dá)到2～3 cm，與既往報(bào)道一致[17]。此時(shí)行超聲和DSA檢查既可避免病灶過小而顯示不清，也可防止病灶過大而導(dǎo)致全身轉(zhuǎn)移。超聲和DSA檢查可為肝臟介入治療提供依據(jù)，已在臨床廣泛應(yīng)用[18]。本研究結(jié)果顯示超聲與病理結(jié)果一致性較好，這提示超聲可作為VX-2白兔肝癌模型的監(jiān)測工具。本研究結(jié)果還顯示對于首次發(fā)現(xiàn)與腫瘤壞死等不同階段白兔肝癌模型的超聲結(jié)果存在顯著差異，提示超聲檢查可動(dòng)態(tài)觀察腫瘤生長情況，為判斷腫瘤病理進(jìn)程提供參考。另外，腫瘤生長至2～3cm時(shí)血管造影也可清晰顯示“抱球征”，這不僅可為進(jìn)一步明確肝癌腫瘤組織血供情況提供依據(jù)，還有助于下一步病理檢查的開展。

綜上所述，復(fù)合麻醉與針道封堵用于超聲引導(dǎo)下肝癌建模術(shù)能顯著提高手術(shù)安全性，彩色多普勒超聲可作為動(dòng)態(tài)監(jiān)測建模術(shù)后腫瘤生長的影像學(xué)檢查工具。