任 崴，黃廷林

(1.西安建筑科技大學 環(huán)境與市政工程學院 陜西省環(huán)境工程重點實驗室，陜西 西安 710055;2.河南科技大學 建筑學院，河南 洛陽 471023)

飲用水安全問題關系到人類生命健康[1-2]，近年來，隨著檢測技術的提高和改進，飲用水中微生物的安全性受到更多的關注[3]，其中由真菌的繁殖帶來的飲用水污染問題日趨普遍，逐漸受到重視[4].真菌在水源水中的生長不僅影響到了水體嗅覺[5]和味覺[6]上的不適，使水處理工藝變得復雜，而且其中致病性及潛在致病性菌的積累容易導致流行性疾病的發(fā)生[7].目前，國內(nèi)外對真菌群落多樣性及其潛在致病性研究多集中于土壤[8]、地表水[9]、自來水[10]、醫(yī)院供水系統(tǒng)[11]等環(huán)境中，而對地下水源水中真菌污染的研究相對較少[12].

可培養(yǎng)微生物通常只占環(huán)境微生物總數(shù)的極小部分，傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離方法只能反映出部分的微生物信息[13]，很難反映出環(huán)境中微生物多樣性的原始狀態(tài)[14].目前利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denature gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)這一分子生物學方法[15]對水環(huán)境中的真菌多樣性研究已有報道，邸詩雨等[9]對西安市典型景觀水體水質(zhì)與微生物種群結構多樣性研究發(fā)現(xiàn)不同水體真菌菌群結構存在明顯差異，莖點霉屬(Phomasp.)真菌是分布在城市景觀水體中的優(yōu)勢種群.王風芹等[16]對賈魯河水體微生物菌群結構季節(jié)動態(tài)變遷研究發(fā)現(xiàn)賈魯河水體和底泥中細菌數(shù)量顯著高于真菌和放線菌數(shù)量，水體中各類群微生物數(shù)量夏秋季高于冬春季，而底泥中細菌、真菌和放線菌數(shù)量春夏季略高于秋冬季.宣淮翔等[17]研究了太湖不同湖區(qū)水生真菌多樣性發(fā)現(xiàn)子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)為優(yōu)勢種群，聚類及典型相關分析表明，太湖不同湖區(qū)水生真菌多樣性存在差異，這與湖區(qū)間不同的營養(yǎng)水平、風浪擾動狀況等因素有關.張利蘭[18]對豫北黃河故道、山東黃河三角洲和河北白洋淀三個不同類型的濕地水體研究發(fā)現(xiàn)真菌主要分布壺菌綱(Chytridiomycetes 16.2%)，黑粉菌綱(Ustilaginomycetes 5.4%)，接合菌綱(Zygomycetes 2.7%)和繡菌綱(Urediniomycetes 21.6%)，三個濕地共有類群為Urediniomycetes，但分布在其不同的種屬.

西北某市屬暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候，夏季炎熱多雨，每到夏季高溫時節(jié)，其常規(guī)水廠的地下水源水中真菌會大量繁殖，形成以絲狀菌、放線菌等為主的微生物絮體，堵塞管道，增大水處理設施的負荷.本研究利用PCR-DGGE分子指紋圖譜技術探究供水系統(tǒng)中真菌種屬多樣性、變化規(guī)律、優(yōu)勢種屬等進行了對比分析，為進一步研究地下水源井中真菌污染控制等方面提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 采樣點概況

課題組研究對象西北某市北郊地下水源地共有54口井，常態(tài)化運行的有32口井[19].本研究在選取其中12個具有代表性的地下水源井為研究對象(表1).

表1 12個水源井概況

1.2 樣品采集

2014年6月采集12個地下水樣品，每個水樣均取5 L用于水質(zhì)分析和微生物群落結構分析，全程無菌操作.

1.3 水質(zhì)指標測定

水質(zhì)指標測定參照環(huán)保部出版的《水與廢水監(jiān)測方法》第四版中的標準方法，詳見表2.

表2 水質(zhì)分析方法及所用儀器

1.4 水體微生物總DNA提取

所用試劑盒為E.Z.N.A.?water DNA Kit(D5525)，美國OMEGA生物公司.主要步驟參考試劑盒使用說明書及王帥[20]論文中的方法

1.5 巢式PCR擴增和DGGE分析

實驗中所用引物設計及擴增程序參考文獻[9, 21]，詳見表3.DGGE圖譜采用Quantity One軟件分析.

表3 真菌巢式PCR引物及條件

1.6 克隆測序

參照WU等的方法[22].

1.7 數(shù)據(jù)分析

Quantity One分析軟件(Version 4.3.1，美國Bio-Rad公司)分析指紋圖譜.軟件分析所得的數(shù)據(jù)進行真菌多樣性分析.

真菌的多樣性水平采用如下指數(shù)考查:

Shannon多樣性指數(shù)

H=-∑PilnPi

在盾構完成穿越橋梁樁基后，對穿越高鐵影響范圍內(nèi)的管片，利用管片上的注漿孔自下而上進行二次注漿，漿液采取快速凝結的雙液漿，注漿壓力不大于0.4MPa，以確保管片壁后空隙填充飽滿。

Pielou均勻度指數(shù)

J=H/lnS

2 結果與分析

2.1 水質(zhì)特征

12個地下水水質(zhì)檢測數(shù)據(jù)見表4.由數(shù)據(jù)可以看出，12個水樣的水溫在18.4～20.8之間，整體變化不大.pH值顯示水體呈弱堿性(8.38～8.78)，溶解氧濃度在8.0～10.5 mg/L之間，均在水環(huán)境正常范圍內(nèi).

表4 12個水體水質(zhì)指標分析

根據(jù)地下水環(huán)境質(zhì)量(GB/T 14848-9)標準值(Ⅲ類)分析，12個水樣中Fe(7，34號井)和Mn(16，37，39號井)水樣超標.

2.2 DGGE 指紋圖譜分析

如圖1所示，DGGE圖譜中的條帶清晰，說明所選擇的生物樣本合適，樣本的稀釋梯度及DNA濃度滿足檢測的要求.在DGGE圖譜中，每個泳道對應一個環(huán)境樣本，每個泳道中不同位置的光亮條帶代表一種真菌種屬，位置不同真菌種屬不同.多個泳道的同一位置的條帶可說明該位置的真菌種屬存在于每個環(huán)境樣本中，通過上述分析以及相關軟件根據(jù)條帶亮度和數(shù)量所賦值計算相應的多樣性指數(shù).

圖1泳道比較圖中的百分數(shù)(%)是其余泳道與第7泳道結構的相似百分比.

如圖1所示：12個樣品通過巢式PCR-DGGE共分離出25個條帶，12個環(huán)境樣本的特征有相同點，也有不同，例如條帶6、14和16是12個樣品共有條帶，條帶23是第10(1)樣品的特有條帶.這說明真菌種屬分布有一定的規(guī)律，DGGE圖譜中，不同環(huán)境樣本所得的條帶數(shù)目并不相同，但對應的真菌種屬有相同之處，說明一些真菌是多個環(huán)境樣本所共有的，而一些環(huán)境樣本中的某一條帶有唯一性，說明這個條帶對應的真菌種屬是別的環(huán)境樣本中所沒有的.

圖1 不同樣品真菌DGGE圖譜及泳道比較圖

2.3 真菌群落結構相似性(Cs)分析

真菌群落結構相似性分析可以得出，34號井和36A號井樣品的相似度最高，達63.3%，說明這兩個樣品的微生物群落結構相似程度比較高，而7號井和16號井樣品的相似度最低，為20.4%.通過UPGMA算法對不同樣點真菌菌群落結構相似性進行聚類分析，結果如表4所示，由圖可知當Cs小于0.4時，樣品分為4大族:7號井樣品單獨為一族，10(1)、41A、43和46號井樣品為第二族，其余樣品為第三族.不同樣品比較，相鄰樣品真菌群落相似性較高，聚類位置相近.

表6 樣品的相似性系數(shù)分析

2.4 真菌DGGE 條帶基因片段測序分析

通過圖譜分析，選擇環(huán)境樣本中的真菌種屬最多作為目標條帶，編號，然后進行割膠、測序.通過測序，將所測序結果與NCBI庫進行表，相似度最高的已知真菌種屬極大可能就是該條帶對應的真菌種屬[8]，詳見表7.

圖2 不同取樣點真菌群落結構相似性的聚類分析

表7 DGGE條帶的序列比對分析

由表7可以看出，6條序列與GenBank中序列的最大相似度都在97%以上.

其中尖刀鏈胞菌(Fusarium oxysporum)和暗球腔菌(Phaeosphaeria fuckelii)為12個水樣中共同存在的真菌種屬.

2.5 真菌與環(huán)境變量之間的相關關系

地下水體中的絲狀真菌來源及生長繁殖是一個復雜的過程，可能受到來至于氣候、降水、溫度、地表環(huán)境及人類活動等方面的影響.但從另一方面分析，水體中的某些水質(zhì)指標及營養(yǎng)物質(zhì)可能是影響其在水體中生長繁殖的重要方面.

利用Excel 2003、Canaco 4.5等軟件分析地下水源井中的真菌與常規(guī)水質(zhì)指標之間的相關關系，結果如圖3所示.從圖3我們可以看出，真菌的生長和常規(guī)水質(zhì)指標DO、pH、溫度、濁度、鐵、錳、TN、TP、氨氮、堿度、COD、TOC存在一定的相關性.不同種屬的真菌與環(huán)境變量的相關性并不相同.pH值和溫度和對鐮刀菌屬(Fusarium.sp)、青霉屬(Penicillium.sp)的生長相關性較大.

圖3 真菌與環(huán)境變量之間的相關關系

3 討論

據(jù)推測，全世界的真菌種類約150萬種，目前已經(jīng)得到鑒定的(包括陸生、水生等約80 000 種)僅占其全部種類的5%左右[23].其中絕大部分不能用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離的方法進行研究.本文利用PCR-DGGE這一無需分離培養(yǎng)微生物的技術，來研究西北某市地下水源井水中真菌種群的分布特征.但該方法對于優(yōu)勢類群的一般只能鑒定到目或科，缺乏更為詳細的分類學信息，有一定的局限性[17].

西北某市地下不同的水源井中真菌多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)分別為0.89～1.33、9～25 和0.405～0.460，表明該地區(qū)地真菌種類較為豐富，這與Elke等[24]人在對德國地下飲用水源的研究結論類似.影響水體中的真菌繁殖的因素很多，如溫度及碳、氮[25]等營養(yǎng)物質(zhì)[17]有關.地下水是一個相對封閉的環(huán)境，水源的補給相對復雜，由圖1 DGGE圖譜可以看出，不同的水源井水中既存在著共同的真菌種屬也有各自特異的種屬，說明不同的位置對其真菌種屬有一定的影響，張利蘭[18]對自然濕地水體真菌群落結構研究表明地理位置對其真細菌群落結構的分布是有明顯的影響的.

通過PCR-DGGE技術得出各樣品間的真菌群落相似性系數(shù)不盡相同，34號井和36A號井樣品的相似度最高，達63.3%，說明這兩個樣品的微生物群落結構相似程度比較高，而7號井和16號井樣品的相似度最低，為20.4%.地下水的補給、循環(huán)和流動是一個非常復雜的過程，不同水樣之間的差異可能和其所處的不同的含水層有關.

同時，通過克隆測序得出的6條序列與GenBank中序列的最大相似度都在97%以上.其中尖刀鏈胞菌(Fusarium oxysporum)和暗球腔菌(Phaeosphaeria fuckelii)為12個樣品中共同存在的真菌種屬，另外，有相當一部分不可培養(yǎng)真菌存在于不同的水樣中，并且尖刀鏈胞菌(Fusarium oxysporum)和暗球腔菌(Phaeosphaeria fuckelii)在純培養(yǎng)試驗中并未培養(yǎng)出(文中未列出純培養(yǎng)實驗結果).這也從另一方面佐證了PCR-DGGE技術作為研究微生物菌落組成及演化規(guī)律的有效方法[26].

地下水體中的絲狀真菌來源及生長繁殖是一個復雜的過程，可能受到來至于氣候、降水、溫度、地表環(huán)境及人類活動等方面的影響.但從另一方面分析，水體中的某些水質(zhì)指標及營養(yǎng)條件可能是影響其在水體中生長繁殖的重要方面[25].

利用Excel 2003、Canaco 4.5等軟件分析地下水源井中的真菌與常規(guī)水質(zhì)指標之間的相關關系，結果如圖3所示.從圖3可以看出，真菌的生長和常規(guī)水質(zhì)指標DO、pH、溫度、濁度、鐵、錳、TN、TP、氨氮、堿度、COD、TOC存在一定的相關性.不同種屬的真菌與環(huán)境變量的相關性并不相同.pH值和溫度和對鐮刀菌屬(Fusarium.sp)、青霉屬(Penicillium.sp)的生長相關性較大.Hamid Moh等人[25]的研究發(fā)現(xiàn)，真菌在C∶N比為1∶1時生長最為迅速，此外，pH值為5.5～6.5與其他pH值相比，顯示出最佳的真菌生長條件.

盡管PCR-DGGE技術對水處理系統(tǒng)微生物群落結構演替規(guī)律的研究有重要意義.但PCR-DGGE技術檢測的DNA片段受片段長度的限制，對較長的片段分離率下降，限制了用于系統(tǒng)發(fā)育分析和探針的序列信息量[27].不同類型真菌種群的rDNA有著相同的遷移行為，一條DGGE帶可能代表幾種菌，也可能不同的幾條DGGE帶代表同一種菌.另一方面，由于PCR、DGGE方法的靈敏度所造成的不能確定代謝活性、細菌數(shù)量和基因表達的水平等也是該技術的局限性.

4 結論

(1)西北某市地下水中真菌種類較為豐富，不同的水源井中既存在著共同的真菌種屬也有各自特異的種屬，真菌多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)分別為0.89～1.33、9～25 和0.405～0.460.

(2)對不同樣點真菌群落相似性進行比較研究得出其相似性系數(shù)存在著一定的關系，相鄰樣點間相似性較高.顯示優(yōu)勢類群主要分布于隱球菌屬(Cryptococcussp.)、暗球腔菌屬(Pluteussp.)、鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、青霉屬(Penicilliumsp.)四種類型真菌普遍存在于地下水源井中，同時也是地下水真菌中的優(yōu)勢種類.

(3)真菌的生長和常規(guī)水質(zhì)指標DO、pH、溫度、濁度、鐵、錳、TN、TP、氨氮、堿度、COD、TOC存在一定的相關性.不同種屬的真菌與環(huán)境變量的相關性并不相同.pH值和溫度和對鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、青霉屬(Penicilliumsp.)的生長相關性較大.

(4)研究為地下水真菌污染控制提供了一定的理論依據(jù).