陳品品，馬曉娟，劉 靚，吳輝煌，林金秀，藍波妙，莊衛(wèi)東*

(1.泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 泉州 362212；2.福建省安溪茶廠有限公司，福建 安溪 362441)

百里香(Thymus)又名麝香草、地椒、蚊子草、山胡椒等，為唇形科(Laiatae)多年生草本或小灌木，因其植株具有強烈的芳香氣味而得名[1]。全世界約有300～400種，我國有11種2變種[2]，主要分布在西北、東北地區(qū)。百里香精油富含單萜、倍半萜和芳香烴等物質(zhì)，具有很強的抗氧化性和抑菌性[3—6]，是優(yōu)良的天然防腐劑、抗氧化劑和食品穩(wěn)定劑[7]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、保健品和化妝品等領(lǐng)域[8—9]，具有較高的商業(yè)價值，國內(nèi)外對百里香屬植物的研究與開發(fā)方興未艾[10—11]。

研究表明，法國百里香(Thymus vulgaris)、五脈百里香(Thymus quinquecostatus)和興安百里香(Thymus dahuricus)等，具有較強的抑菌活性[12—14]。對闊葉百里香(Thymus pulegioides)精油成分及抑菌活性研究未見報道。百里香精油成分地區(qū)性差異明顯。近年來，福建泉州地區(qū)引進栽培的幾種百里香中，闊葉百里香和原生百里香(Thymus vulgaris)歸類為百里香酚型，檸檬金邊百里香(Thymus citriodorus)歸類為香葉醇型，與前人研究結(jié)果差異較大[15—16]。闊葉百里香精油所含的百里香酚含量和含油率最高，且鮮葉采收量大，適宜推薦種植。泉州地區(qū)悶熱潮濕的特殊氣候?qū)е乱N栽培的闊葉百里香存在枯萎期(4～7月)，枯萎期的新鮮莖葉出現(xiàn)部分枯萎腐爛，從而影響鮮樣采收。目前未見對闊葉百里香鮮樣和干樣精油成分進行分析和抑菌效果比較的相關(guān)報道。本研究以泉州地區(qū)種植的闊葉百里香為試材，提取鮮、干闊葉百里香精油，討論鮮、干莖葉精油含油率、成分差異及抑菌效果，為本地區(qū)闊葉百里香的有效開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

實驗型精油提取機組(JYT-20L，上海矩源機械設(shè)備有限公司)，低溫冷卻液循環(huán)泵(DLSB-5/20，杭州庚雨儀器有限公司)，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890B-5977C，美國安捷倫)，電子天平(CP2202C，上海奧豪斯儀器有限公司)，烘干機(JY-6LHG-7，福建佳友機械有限公司)。

1.1.2 材料

自泉州市農(nóng)業(yè)科技園區(qū)香草引種圃內(nèi)采集長勢良好的闊葉百里香，取地上部分莖葉，留部分新鮮莖葉為鮮樣；部分新鮮莖葉置于烘干箱，控溫(50±1) ℃，烘干至質(zhì)量不變即為干樣。

試驗用 3種真菌為鏈格孢菌(Alternaria brassicae)、粉紅單端孢(Trichothecium roseum)和意大利青霉(Penicillium italicum)，由番茄中分離、純化、鑒定后得到。

1.2 方法

1.2.1 精油提取與含油率

水蒸氣蒸餾法提取百里香精油。取實驗材料1.00 kg，剪碎，放入精油提取器中，設(shè)置蒸餾溫度105 ℃、鍋爐溫度110 ℃、蒸餾時間2 h，收集精油，稱量精油重量(kg)。提取5次，取平均值，根據(jù)精油重量計算含油率。

1.2.2 GC-MS分析條件

氣相色譜條件：色譜柱為 HP-5MS (30 m ×0.25 mm × 0.25 μm)，進樣口溫度 230 ℃；載氣為高純氦氣(99.999%)，恒定流量 0.8 mL·min-1；分流比50:1；進樣量1.0 μL。升溫程序：初始溫度45 ℃，以 15 ℃·min-1升至 75 ℃，以 0.5 ℃·min-1升至 85 ℃，以 1 ℃·min-1升至 95 ℃，以 3 ℃·min-1升至 170 ℃，以 5 ℃·min-1升至 250 ℃，保持 2 min。

質(zhì)譜條件：四級桿溫度 150 ℃，離子源溫度250 ℃，電離方式EI電離，電子能量70 eV，掃描范圍50～600 m/z，溶劑延遲時間5 min；采集方式選擇SCAN掃描。

1.2.3 樣品制備

精油制備：用 0.002%吐溫-80將精油配制成10 μL·mL-1濃度，超聲波處理5 min備用。

菌懸液制備：取3種供試菌分別裝入有10 mL無菌水的試管中，配制成105個·mL-1的孢子懸浮液，用振蕩器混合均勻備用。

1.2.4 最低抑菌濃度(MIC)測定

用二倍稀釋法配制濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 μL·mL-1精油培養(yǎng)基，每濃度重復(fù)3次，以無毒培養(yǎng)基為對照，培養(yǎng)72 h，觀察真菌生長情況，測定菌落直徑，以完全沒有供試菌生長的濃度為最低抑菌濃度(MIC)。

1.2.5 抑菌圈(DZI)測定

采用打孔法測定。用打孔器在菌懸液涂培養(yǎng)基平板等位置處打成直徑6 mm圓孔在孔中加入10 μL精油，用吐溫-80作為對照。靜置5 min，28 ℃培養(yǎng)72 h后測量抑菌圈直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

精油各成分經(jīng)過氣相色譜-質(zhì)譜分離，質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及NIST 2014標準質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫比對，并采用峰面積歸一化法進行定量分析，計算各成分的相對百分含量。用SPSS v16.0軟件統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮、干樣精油出油率比較

采用水蒸氣蒸餾法提取闊葉百里香精油，鮮樣精油含油率0.53%，干樣精油含油率0.37%。精油呈特殊香味，鮮樣精油呈淡黃色，干樣精油呈棕黃色。

2.2 鮮、干精油成分分析

運用GC-MS分析技術(shù)對鮮、干百里香精油成分進行分析，得到樣品的總離子流圖(TIC)(圖1)、精油組成成分及其相對含量(表1)。從闊葉百里香鮮樣精油中鑒定出35個化合物，占總量的95.11%；從干樣精油中鑒定出40種化學(xué)成分，占總量的91.12%。

圖1 闊葉百里香精油總離子流(TIC)圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of essential oil of Thymus pulegioidesA.鮮闊葉百里香精油；B.干闊葉百里香精油

由表1可知，闊葉百里香精油主要由萜烯類、醇類、醚類、酚類等多種化學(xué)物質(zhì)組成，其中萜烯類的組成種類最多，有23種，多為單萜和倍半萜；酚類只有百里香酚1種，相對含量卻最高。鮮、干百里香精油成分大致相同，主要成分為百里香酚、百里酚甲醚、右旋龍腦、雙環(huán)[5.2.0]壬烷、2-亞甲基-4,8,8-三甲基-4-乙烯基、異百里酚甲醚和鄰傘花烴等。在鮮樣精油中含量較高的成分依次為百里香酚(31.30%)、麝香草酚甲醚(12.80%)、右旋龍腦(7.18%)、雙環(huán)[5.2.0]壬烷,2-亞甲基-4,8,8-三甲基-4-乙烯基(5.32%)、反式-α-沒紅藥烯(5.21%)和異麝香草酚甲醚(5.00%)。干樣精油中含量較高的成分依次為百里香酚(26.82%)、麝香草酚甲醚(12.65%)、右旋龍腦(7.40%)、鄰傘花烴(6.30%)、雙環(huán)[5.2.0]壬烷,2-亞甲基-4,8,8-三甲基-4-乙烯基(6.18%)、異百里酚甲醚(5.98%)和 α-雪松烯(4.99%)。

表1 闊葉百里香精油化學(xué)成分及其相對含量Table 1 Volatile chemical compositions and relative contents of essential of Thymus pulegioides

闊葉百里香鮮樣和干樣精油共有成分有30種，相對含量差異超過1%的成分僅有5個，分別為百里香酚、γ-松油烯、鄰傘花烴、α-雪松烯、反式-α-沒紅藥烯。鮮樣有5個特異性成分，分別為安息香醛、左旋-β-蒎烯、乙酮 1-(2,4,5三甲基苯基)、1-癸醇和左旋乙酸冰片酯，其相對含量之和為 1.06%；干樣有 10個特異性成分，分別為 γ-檸檬烯、左旋-α-松油醇、α-松油醇、β-波旁烯、γ-穆勒烯、α-沒紅藥醇、十五醛、植酮、8,9-脫氫百里酚甲基醚和植醇，相對含量之和為1.42%；2種精油的特異性成分相對含量所占比例較小。

鮮樣精油相對含量高于3%的主成分有鄰傘花烴、γ-松油烯、左旋樟腦、右旋龍腦、麝香草酚甲醚、異百里酚甲醚、百里香酚、2-亞甲基-4,8,8-三甲基-4-乙烯基雙環(huán)[5.2.0]壬烷、α-雪松烯、反式-α-沒紅藥烯等10種。干樣精油相對含量高于3%的主成分除了沒有γ-松油烯外，與鮮樣精油主成分基本一致，各成分的相對含量有所差異；含量差異最大的成分是百里香酚；鮮、干樣精油主成分分別占精油總量比例83.15%和77.64%。

2.3 鮮、干樣精油抑菌效果比較

通過測定抑菌圈直徑(DIZ)和最低抑菌濃度(MIC)判斷鮮、干莖葉精油對鏈格孢菌、粉紅單端孢和意大利青霉 3種真菌的抑制效果。由表 2知，2種精油對鏈格孢菌、粉紅單端孢和意大利青霉均有較強的抑菌效果。鮮、干樣精油對鏈格孢菌的抑菌效果最為明顯(DIZ達30.70 mm和28.16 mm，MIC皆為0.4 μL·mL-1)；鮮樣精油對3種真菌的抑菌效果好于干樣精油。

表2 百里香精油抑菌效果Table 2 The minimum inhibitory concentration(MIC) and diameters of inhibition zone (DIZ) of thyme oil

3 討論

3.1 闊葉百里香鮮樣、干樣精油成分比較分析

本研究提取的鮮、干闊葉百里香精油含油率分別為0.53%、0.37%。精油呈特殊香味，鮮百里香精油呈淡黃色透明狀，干百里香精油呈棕黃色。供試的闊葉百里香精油含油率高于多數(shù)已報道的百里香精油含油率[17—19]。

闊葉百里香精油共鑒定出45種化學(xué)成分，主要由萜烯類、醇類、醚類、酚類等多種化學(xué)物質(zhì)組成，萜烯類的組成種類最多，有23種，多為單萜和倍半萜；主要成分有百里香酚、麝香草酚甲醚右旋龍腦、雙環(huán)[5.2.0]壬烷,2-亞甲基-4,8,8-三甲基-4-乙烯基、異百里酚甲醚和鄰傘花烴等。黃建等[16]研究的結(jié)果有較大差異，闊葉百里香主要成分為香芹酚(33.94%)和香葉醇(11.75%)。同品種、不同產(chǎn)地的百里香精油成分和含量存在差異，可能是由地理環(huán)境、氣候條件等因素引起的[20]。

此外，鮮、干樣精油的共有成分有30種，各成分含量存在差異，蒈烯、水芹烯具有松樹清香，4-萜烯醇具有胡椒香、較淡的泥土香等[20]。特異性成分共有15種，安息香醛有苦杏仁味，蒎烯具有松節(jié)油香氣，檸檬烯具有強烈的檸檬清香，乙酸冰片酯具有清涼的松木香氣，松油醇具有丁香味，癸醇具有甜的花香[21—22]。主成分(相對含量高于3.00%)基本一致，各成分的相對含量有所差異；含量差異最大的成分是百里香酚；γ-松油烯僅是鮮樣的主成分，研究表明γ-松油烯具有柑橘和檸檬香氣，具有抗菌和抗氧化作用[22]。這些成分含量差異共同影響著闊葉百里香鮮、干樣精油的整體氣味。

3.2 闊葉百里香鮮樣、干樣精油抑菌效果分析

通過抑菌圈和最低抑菌濃度值的測定，可以發(fā)現(xiàn)鮮、干百里香精油對3種病原菌有不同程度的抑制作用，對鏈格孢菌的抑制效果最好(DIZ值分別為30.70 mm 和 28.16 mm，MIC 值為 0.4 μL·mL-1)，其次為粉紅單端孢和意大利青霉。鮮樣精油的抑菌效果好于干樣精油，這一結(jié)果與鮮樣精油的百里香酚、γ-松油烯等成分相對含量較高有關(guān)，這些成分具有較強的抗氧化和抑菌作用[11]。闊葉百里香精油對采后病原菌有較好的抑制作用，為果蔬采后保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。