楊佩儒，文 彬，趙燭芳

(1.中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園熱帶植物資源與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 勐臘 666303；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201)

柚子是重要的經(jīng)濟(jì)作物。中國(guó)很早就有關(guān)于柚的記載，晉代學(xué)者郭璞在《爾雅》的注釋中就有“柚屬也，子大于盂，皮厚二、三寸，中似枳 ,食之少味”[1]，說(shuō)明柚類在中國(guó)具有悠久的種植歷史。同時(shí)，中國(guó)還是柚的起源中心和分布中心，且種植面積大、產(chǎn)量高、品種多[2]。然而，近年來(lái)由于優(yōu)良品種的推廣，一些傳統(tǒng)品種處于流失的邊緣[2]。為了柚子的可持續(xù)發(fā)展，保護(hù)柚類品種的遺傳多樣性，研究柚類種子的保存刻不容緩。

種子根據(jù)其貯藏特性一般分為3類，即正常性種子、頑拗性種子和中間型種子[3—4]，正常性種子能耐低溫和脫水，適合在低溫干燥條件下保存；頑拗性種子不耐脫水且對(duì)低溫敏感，常規(guī)條件很難保存；而中間型種子不能忍受像正常性種子那樣的脫水，但在脫水到相對(duì)低的含水量時(shí)還能存活[5]。

柚類種子根據(jù)貯藏行為可以歸類到中間型種子[2,6]，目前超低溫保存是唯一有希望實(shí)現(xiàn)頑拗性/中間型種子長(zhǎng)期貯藏的方法[7]。依據(jù)工作原理可將超低溫保存分為兩類：一類是依據(jù)冷凍脫水的原理，結(jié)合程序降溫技術(shù)，利用程序降溫儀或連續(xù)降溫冰凍裝置等儀器設(shè)備控制降溫速度，存活關(guān)鍵在于降溫冷凍環(huán)節(jié)；另一類則是根據(jù)玻璃化原理，采用快速降溫的方法[8]，主要技術(shù)包括包埋-干燥法、玻璃化法和滴凍法等[9—10]。

超低溫保存能否成功是由材料特性、預(yù)培養(yǎng)方法、冷凍保護(hù)劑、冷凍方法等因素共同決定的[10]。關(guān)于柑橘屬植物種子和柑橘屬植物種質(zhì)資源的超低溫保存，已經(jīng)有了比較多的研究。Pérez等[11]在1997年成功地超低溫保存了四個(gè)品種的橙(Citrus sinensis)，三個(gè)品種的葡萄柚(C. paradisi)，以及來(lái)檬(C. arantifolia)、檸檬(Citrus limon)、酸橙(C.aurantium)的胚性愈傷組織。在 1998年，Gonzalez-Arnao等[12]使用包埋脫水法實(shí)現(xiàn)對(duì)來(lái)檬莖尖的超低溫保存。2002年，Al-Ababneh等[13]同時(shí)采用包埋玻璃化法、玻璃化法和包埋脫水法三種方式超低溫保存酸橙的莖尖，三種方式都取得成功，而包埋脫水法效果最佳。Gonzalez-Arnao等[14]使用包埋脫水法超低溫保存了橙、檸檬、葡萄柚、柑橘(C.reticulata)和酸橙的體細(xì)胞胚。但是，目前還沒(méi)有關(guān)于將程序降溫儀應(yīng)用于柚種子超低溫保存的報(bào)道。因此，探索柚類種子的超低溫保存方法，研究不同的脫水、降溫速率以及預(yù)冷末溫度等因素對(duì)種子超低溫保存的影響，有利于豐富柚種子的保存方法，為中間型種子的保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄柚(Citrus paradise)屬蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)。實(shí)驗(yàn)所用的“小甜柚”是葡萄柚的一個(gè)品種，引種自越南，20世紀(jì) 60年代由中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園選育成功，在西雙版納有較大的種植面積，為當(dāng)?shù)匾环N重要的經(jīng)濟(jì)作物。小甜柚樹(shù)體高大，樹(shù)勢(shì)強(qiáng)健，樹(shù)冠圓頭形，枝梢粗壯。果實(shí)10月初成熟，耐貯藏[15—16]。

葡萄柚種子均采自位于云南省西雙版納傣族自治州勐臘縣勐侖鎮(zhèn)的西雙版納熱帶植物園。為避免環(huán)境等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，種子盡量采自同一片種植園。整個(gè)實(shí)驗(yàn)共采集成熟的葡萄柚果實(shí)約300個(gè)。從果實(shí)取出種子，室內(nèi)攤開(kāi)放置1 d，待種皮稍晾干后，手工剝除外種皮，然后測(cè)定種子千粒重、初始含水量和成苗率。剩余種子置于密封袋中放在15 ℃冷庫(kù)中保存?zhèn)溆茫话惚４娌怀^(guò)7 d。

1.2 方法

1.2.1 種子基本參數(shù)測(cè)定

種子千粒重：隨機(jī)取樣，每次100粒，重復(fù)取樣10次，使用精度萬(wàn)分之一克的電子天平稱重。計(jì)算百粒種子的平均重量，然后換算成千粒重。

種子含水量：按國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)推薦的油料種子含水量測(cè)量方法測(cè)定[17]。將種子稱鮮重后，置于103±2 ℃烘箱中烘干17±1 h稱干重。每處理使用單粒種子的8個(gè)重復(fù)。含水量計(jì)算公式：

種子成苗率：將種子尖端朝上插入1%瓊脂，置于30±1 ℃恒溫萌發(fā)箱中萌發(fā)。每20粒為一重復(fù)，播種5～6個(gè)重復(fù)。每周觀測(cè)一次種子萌發(fā)情況，持續(xù)3個(gè)月。以胚根伸出種皮5 mm為萌發(fā)或存活，種子長(zhǎng)成形態(tài)學(xué)上完整的幼苗為成苗。另外，為了防止吸脹傷害，脫水處理的種子在播種前需置于空氣濕度接近飽和的環(huán)境中吸濕，即將種子放在無(wú)蓋的小培養(yǎng)皿中，然后把小培養(yǎng)皿放入底部盛有少量水分的大培養(yǎng)皿中，蓋上大培養(yǎng)皿，放入30 ℃恒溫萌發(fā)箱中，24 h后取出播種。

1.2.2 不同脫水速率處理

脫水過(guò)程分為兩步，第一步是以3種脫水速率將種子脫水至約20%含水量。具體方法：將新鮮的種子分成3份(每份3000粒)，分別單層平鋪放置在溫度為15 ℃和相對(duì)濕度(RH)分別為15%(種子庫(kù)干燥間1)、50%(種子庫(kù)干燥間2)、75%(盛有NaCl飽和溶液的保鮮盒)的三種環(huán)境下脫水，定期取樣測(cè)量種子含水量。當(dāng)含水量達(dá)20%左右，進(jìn)入第二步。

第二步將上述3種脫水處理的種子各分為10份(每份300粒)，分別放入10個(gè)盛有不同種飽和鹽溶液的聚乙烯保鮮盒中，于15 ℃條件下保存。兩周后每周取出種子檢測(cè)含水量，連續(xù)兩次測(cè)量結(jié)果無(wú)明顯變化后視為達(dá)到水分平衡。實(shí)驗(yàn)所用10種飽和鹽溶液是 KCl (85% RH)、(NH4)2SO4(81% RH)，NH4Cl(78% RH)、NaCl (75% RH)、NaNO3(62% RH)、Mg(NO3)2(54% RH)、K2CO3(45% RH)、MgCl2(34%RH)、CH3COOK (23% RH)和 KOH (8% RH)[18]。

經(jīng)飽和鹽溶液處理的水分平衡的種子分為兩小份(每小份120粒)，一小份吸濕處理后直接播種進(jìn)行活力檢測(cè)(對(duì)照)，另一小份用簡(jiǎn)單二步法超低溫保存后播種。具體作法：先將種子裝入約50 mL塑料瓶，放入家用冰箱冷凍室保持 2 h，取出后立即投入液氮，在液氮中貯藏24 h，然后取出，投入50 ℃水浴2～3 min，使其恢復(fù)室溫。吸濕后檢測(cè)種子活力[2]。

種子脫水速率按Samarah的方法計(jì)算，即：

其中，Si和Si+1分別是樣品i和i+1的種子水分含量，di+1是對(duì)樣品i+1實(shí)施干燥處理的天數(shù)[19]。

1.2.3 不同降溫速率和預(yù)冷末溫度處理

該實(shí)驗(yàn)使用的種子先按上述方法在15 ℃、50%RH干燥間脫水至約 12%含水量，然后使用程序降溫儀進(jìn)行預(yù)冷處理。

1.2.3.1 不同降溫速率實(shí)驗(yàn)

將同一批種子分為10份(每份120粒)，每?jī)煞轂?1 組，共 5 組，分別以-0.25 ℃·min-1、-0.5 ℃·min-1、-1 ℃·min-1、-2.5 ℃·min-1和-5 ℃·min-1降溫速率將種子從 4 ℃冷凍至-40 ℃。完成第一步冷凍(預(yù)冷)的兩份種子，一份取出后按1.2.2中方法投入50 ℃水浴解凍，然后吸濕、播種(對(duì)照)；另一份投入液氮，在液氮中保存24 h后再取出解凍、吸濕、播種。

1.2.3.2 不同預(yù)冷末溫度實(shí)驗(yàn)

將同一批種子分為6份(每份120粒)，每?jī)煞轂?組，共 3組，以-1 ℃·min-1降溫速率分別降至-40 ℃、-50 ℃、-60 ℃，完成預(yù)冷。然后再按1.2.3.1中方法完成超低溫保存的第二步冷凍(超低溫處理)和(或)對(duì)照實(shí)驗(yàn)的解凍、吸濕、播種。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用 Microsoft Excel 2010統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，GraphPad Prism軟件制圖，SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、多重比較、非參數(shù)檢驗(yàn)；采用概率單位回歸方法計(jì)算半致死含水量MC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脫水速率對(duì)種子超低溫保存的影響

葡萄柚種子平均百粒重40.810g±0.619，千粒重為408.10 g，初始含水量為42.181%。二步脫水的第一步說(shuō)明不同處理存在明顯的脫水速率差異(圖1)，其脫水速率指數(shù)分別為11.66 (15% RH)，9.06 (50%RH)和3.40 (75% RH)。脫水至約20%后放入10種飽和鹽溶液中平衡，平衡后的種子最終含水量為3%～11%(表 1)。

圖1 不同環(huán)境下種子含水量的變化Fig. 1 Changes in seed moisture contents in different dehydration regimes

隨著含水量的降低，脫水后種子的成苗率也不斷降低。同時(shí)，不同脫水速率處理后的種子的成苗率各有不同，脫水速度越快，種子的脫水敏感性越高。3種空氣相對(duì)濕度(15%、50%、75%)條件下脫水后的種子成苗率差異顯著(P<0.05)，在相對(duì)濕度分別為75%、50%、15%環(huán)境下脫水的葡萄柚種子中，半致死含水量MC50分別為5.169、6.817、12.514，成苗率呈75% RH>50% RH>15% RH，即相同含水量的種子，脫水速度越慢成苗率越高(表1)。

超低溫處理進(jìn)一步降低了種子的成苗率，超低溫保存的種子與脫水對(duì)照的種子相比，成苗率有顯著差異(P<0.05)(表 1)。含水量對(duì)超低溫保存后的萌發(fā)有重要影響，含水量 6%～8%之間的種子成苗率最高。但是，以不同速率脫水的種子在超低溫保存后，種子成苗率總體上沒(méi)有顯著差異(P>0.05)(表1)。不過(guò)，在種子含水量7%左右時(shí)，超低溫保存后成苗率15% RH>75% RH>50% RH，而在75% RH脫水到含水量8%的種子冷凍后成苗率最高，并且遠(yuǎn)高于15% RH和50% RH。

表1 10種飽和鹽溶液平衡脫水后葡萄柚種子含水量及其種子脫水、超低溫保存的成苗率Table 1 Moisture content of grapefruit seeds after dehydration in ten saturated salt solutions and the emergence of dehydrated and cryopreserved seeds

2.2 預(yù)冷對(duì)種子超低溫保存的影響

脫水到12%含水量的葡萄柚種子，使用不同的慢速降溫速率從4 ℃降至-40 ℃，第一步冷凍后的成苗率有顯著差異(P<0.05)，以-2.5 ℃·min-1的速率降溫的種子成苗率最高；-5 ℃·min-1降溫的種子成苗率最低，并與以-2.5 ℃·min-1、-1 ℃·min-1降溫的種子差異顯著。放入液氮超低溫處理后，總體趨勢(shì)是隨著降溫速率的降低成苗率升高，并以-0.5 ℃·min-1和-0.25 ℃·min-1速率降溫的種子成苗率較高，分別達(dá)到 11.67%和 10.83%。與預(yù)冷對(duì)照的種子比較，經(jīng)歷超低溫處理后的種子成苗率顯著降低(P<0.05)，以-2.5℃·min-1降溫的種子成苗率變化最大，-0.5 ℃·min-1降溫的種子成苗率變化最小(圖 2: A)。

預(yù)冷末溫度方面，以-1 ℃·min-1速率降溫至不同末溫度，第一步降溫后，預(yù)冷末溫度為-40 ℃的種子成苗率最高，并與-50 ℃和-60 ℃成苗率差異顯著(P<0.05)。液氮超低溫處理后，預(yù)冷到-60 ℃的種子成苗率最高，但與其他溫度的種子無(wú)顯著性差異。液氮冷凍處理顯著降低種子成苗率，與預(yù)冷對(duì)照比較，預(yù)冷溫度為-40 ℃的種子成苗率變化最大(圖2:B)。

圖2 不同速率預(yù)冷(A)、預(yù)冷末溫度(B)及其超低溫保存后種子成苗率Fig. 2 Emergence of seeds precooled at different cooling rate, final temperatures and cryopreserved

3 討論

一般對(duì)于未完全成熟的正常性種子而言，慢速脫水比快速脫水更有利于提高種子的脫水耐性[20]；而對(duì)于頑拗性種子，快速脫水比慢速脫水更好[21]。對(duì)于葡萄柚這種中間型種子來(lái)說(shuō)，還需對(duì)其脫水條件進(jìn)一步研究。文彬等[2]對(duì)西雙版納柚子10個(gè)品種進(jìn)行研究，所有品種的種子含水量下降至10%時(shí)，種子生命力基本不受影響；但是不同品種間種子的脫水耐性也并不一樣，使種子生命力受到影響的臨界含水量不盡相同，從 7%～9%不等，冷凍種子出苗率22%～86%。張楠等[6]研究葡萄柚種子超低溫耐性發(fā)育及硅膠快速脫水與飽和鹽慢速脫水對(duì)超低溫保存的影響，表明快速脫水與慢速脫水的種子成苗率差異顯著，脫水使種子受到一定的傷害，而且超低溫保存后快速脫水比慢速脫水好。本研究中，葡萄柚種子在3種速率慢速脫水之后，成苗率都有一定的降低，且15% RH<50%RH<75%RH；超低溫保存后種子的成苗率又進(jìn)一步降低，說(shuō)明脫水和冷凍過(guò)程都會(huì)對(duì)種子造成損傷。在慢速脫水的情況下，脫水速度越快對(duì)種子造成的傷害越大，但是超低溫保存后種子成苗率并無(wú)顯著差異，即在慢速脫水中脫水速率的變化對(duì)超低溫保存影響較小甚至沒(méi)有影響。種子含水量是影響超低溫保存的重要因素，6%～8%應(yīng)是葡萄柚種子超低溫保存的最適含水量，與前人的結(jié)果相似[6]。

超低溫保存的過(guò)程中由于會(huì)經(jīng)歷劇烈的升溫和降溫，這種溫度的變化可能會(huì)在細(xì)胞內(nèi)部形成冰晶，對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷以及對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和酶活性造成影響，超低溫保存的關(guān)鍵就是要避免這些損傷的發(fā)生。玻璃化法是先把材料經(jīng)過(guò)玻璃化處理和(或)以足夠快的降溫速度使液體玻璃化，避免冰晶的生成。兩步降溫法是以較慢的降溫速度，先從0 ℃降到-30 ℃至-50 ℃的預(yù)冷溫度，使細(xì)胞體外及細(xì)胞間隙的溶液先部分凍結(jié)，而細(xì)胞內(nèi)尚未結(jié)冰，胞外溶液由于結(jié)冰溶質(zhì)濃度不斷升高，造成細(xì)胞內(nèi)外溶質(zhì)濃度差，使得胞內(nèi)水份通過(guò)細(xì)胞膜向外滲透，即冷凍脫水，脫去細(xì)胞內(nèi)多余的水分，防止發(fā)生冷凍傷害。只要降溫速率控制得當(dāng)，細(xì)胞內(nèi)的水分就能不斷地向細(xì)胞外擴(kuò)散，細(xì)胞原生質(zhì)濃縮，從而降低了細(xì)胞原生質(zhì)的冰點(diǎn)，使細(xì)胞達(dá)到適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)性脫水，然后迅速投入液氮之中保存[22]。本研究關(guān)注二步法中第一步的降溫速率與預(yù)冷末溫度，相較于原先使用的簡(jiǎn)易二步法，種子保存后的成苗率有略微提升，說(shuō)明使用程序降溫儀控制降溫速率的二步法有助于葡萄柚種子的超低溫保存。需要說(shuō)明的是，本研究中第一步的降溫速度和預(yù)冷末溫度對(duì)超低溫保存的結(jié)果都有影響，但是，由于實(shí)驗(yàn)材料的限制，研究中并沒(méi)有把實(shí)驗(yàn)所得的最佳降溫速度(-0.5 ℃·min-1和-0.25 ℃·min-1)和最佳預(yù)冷末溫度(-60 ℃)組合起來(lái)，可以在后續(xù)的工作中嘗試更多的降溫速度和預(yù)冷末溫度組合提高超低溫保存后葡萄柚種子的成苗率。

值得注意的是，Zhang等[6]在硅膠快速脫水和飽和鹽慢速脫水后超低溫保存的比較研究中，快速脫水結(jié)果比慢速脫水好；而本研究中，脫水速率對(duì)超低溫保存結(jié)果無(wú)影響，這可能是因?yàn)楸狙芯侩m然采用了3種不同的脫水速率，但是都在慢速脫水的范疇中。在快速脫水與慢速脫水之間可能存在一個(gè)臨界值，找到這個(gè)值有助于完善種子超低溫保存方法。另外，在二步法的超低溫保存實(shí)驗(yàn)中，預(yù)冷后的種子跟液氮處理后的種子成苗率差別很大，說(shuō)明預(yù)冷過(guò)程可能沒(méi)有把種子中的自由水分全部移除，在接下來(lái)的液氮處理過(guò)程中有進(jìn)一步的傷害發(fā)生。