樂敏莉， 向輝華， 李 飛， 胡家美

頸動脈狹窄發(fā)病率呈逐年升高趨勢［1-2］。頸動脈狹窄疾病進展易引起患者認(rèn)知功能下降， 其主要原因是腦組織灌注降低［3］。頸動脈支架植入術(shù)是改善頸動脈狹窄患者腦組織灌注量的常用手段，可改善患者認(rèn)知功能［4］，但其機制尚未完全闡明。 微RNA(miRNA，miR)是一種非編碼單鏈RNA，已證實參與多種疾病病理進程［5-6］。 miR-24 是miRNA 家族成員，細(xì)胞試驗研究證實其在缺氧條件下可通過抑制SH-SY5Y 細(xì)胞中神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)參與神經(jīng)元損傷過程［7］，而認(rèn)知功能損傷與神經(jīng)元受損密切相關(guān)［8］。本研究旨在通過分析miR-24 與頸動脈狹窄患者支架植入術(shù)后認(rèn)知功能變化的關(guān)系，探討支架植入術(shù)改善患者認(rèn)知功能的可能機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2017 年2 月至2019 年2 月湖北民大醫(yī)院收治的135 例頸動脈狹窄患者作為研究對象。 頸動脈狹窄診斷符合 《頸動脈狹窄診治指南》［9］中標(biāo)準(zhǔn)。 患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①DSA 檢查證實單側(cè)或雙側(cè)頸動脈狹窄＞70%； ②術(shù)前未接受對癥治療； ③無凝血功能障礙； ④對治療藥物無禁忌證；⑤接受頸動脈支架植入術(shù)；⑥簽署手術(shù)知情同意書。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有認(rèn)知功能障礙；②存在乙醇依賴史；③術(shù)前服用改善認(rèn)知功能藥物；④既往接受顱腦手術(shù)或頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)； ⑤頸動脈嚴(yán)重鈣化；⑥伴有顱內(nèi)動脈瘤；⑦主動脈弓分支嚴(yán)重扭曲；⑧嚴(yán)重心、肺、肝、腎功能不全；⑨中途退出和不能完成隨訪。 135 例頸動脈狹窄患者中男97例，女38 例；年齡40～76 歲，平均(68.73±7.03)歲；體質(zhì)量指數(shù)(24.78±3.40) kg/m2；單側(cè)狹窄82 例，雙側(cè)狹窄53 例，平均頸動脈狹窄為(82.56±6.60)%；平均受教育年限(8.70±2.61)年。 本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 支架植入術(shù)

患者入院后接受詳細(xì)檢查，明確基本情況后給予對癥治療。 采用Innova 3100 DSA 機(美國通用公司)完成手術(shù)。 利多卡因局部麻醉后，穿刺股動脈并置入6 F/8 F 鞘， 依據(jù)血管造影選擇合適的球囊和支架；肝素抗凝，將指引導(dǎo)管置入頸總動脈中段，于血管遠(yuǎn)端放置保護濾器；先行球囊預(yù)擴張，后植入自膨式頸動脈支架(圖1)，局部縫合加壓包。術(shù)前3 d始口服氯匹格雷(50 mg/d)和阿司匹林(100 mg/d)，術(shù)后長期維持。

圖1 頸動脈狹窄患者支架植入術(shù)影像

1.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測

抽取患者術(shù)前及術(shù)后6 個月外周靜脈血10 mL，室溫下4 000 r/min 離心15 min，離心半徑8 cm，分離上層血清，置于-20℃冰箱，待測。 采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測血清miR-24 相對表達(dá)量，TRIzol 試劑提取血清中總RNA， 將2 ng 總RNA 添加至20 μL 反應(yīng)液中，采用TaqMan miRNA檢測試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR 擴增， 反應(yīng)條件：95℃1 min，95℃45 s，15 s 退火，72℃45 s，40個循環(huán)。 以β-肌動蛋白(actin)為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt表示miR-24 相對表達(dá)量。 引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 認(rèn)知功能評價

同一神經(jīng)心理學(xué)醫(yī)師評定患者術(shù)前及術(shù)后6個月認(rèn)知功能。 采用蒙特利爾認(rèn)知評估量表(MoCA)評估認(rèn)知功能，總分30 分，≥26 分為正常，＜26 分為認(rèn)知功能障礙［10］；畫鐘測試(CDT)評估患者時間、空間定向概念，共10 分，分?jǐn)?shù)越低認(rèn)知功能越差［11］；額葉功能評定量表(FAB)評估執(zhí)行功能，共6 個條目，每個條目3 級評分，總分越高，執(zhí)行功能越好［12］；聽覺詞語學(xué)習(xí)測試(AVLT)評估患者記憶力，對15個名詞連續(xù)5 次學(xué)習(xí)和回憶，對另15 個“干擾”名詞進行學(xué)習(xí)會議， 并在30 min 后回憶第一組詞，前5 次會議正確的總數(shù)為記憶得分，＞4 分為正常［13］；符號-數(shù)字模式測試(SDMT) 測評患者注意力，90 s內(nèi)按順序?qū)懴鄳?yīng)符號，正確填寫一個記1 分，最高90 分［14］；Rey-Osterriech 復(fù)雜圖形測試(CFT)評 估患者視覺空間感知能力， 將復(fù)雜圖形分成18 個記分單位，3 級評分法，根據(jù)所畫圖形和相應(yīng)位置是否正確評分，最高36 分［15］。

1.5 頸動脈狹窄評價

根據(jù)北美放射年會超聲會議頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)協(xié)作組制定的標(biāo)準(zhǔn)［16］，評估頸動脈狹窄程度：狹窄率＜50%為輕度狹窄，50%～69%為中度狹窄，70%～99%為重度狹窄，100%為閉塞。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。 服從正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，治療前后比較用配對樣本t檢驗； 計數(shù)資料以例（率）表示，用卡方檢驗。 miR-24 變化值與認(rèn)知功能變化相關(guān)性用Pearson 卡方檢驗及多元線性回歸分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

135 例頸動脈狹窄患者支架植入術(shù)均獲成功。所有患者完成隨訪，無失訪。

2.1 不同狹窄程度miR-24 相對表達(dá)量

輕度狹窄(n=31)、中度狹窄(n=48)、重度狹窄(n=53)、閉塞(n=3)患者miR- 24 相對表達(dá)分別為(0.99±0.23)%、(0.76±0.20)%、(0.61±0.17)%、(0.29±0.14)%,4 組患者間miR-24 相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.04,P＜0.001)，閉塞患者miR-24 相對表達(dá)量最低。

2.2 手術(shù)前后認(rèn)知功能比較

頸動脈支架植入術(shù)后患者總體認(rèn)知功能較術(shù)前有明顯改善，主要體現(xiàn)在時間、空間定向概念、注意力、記憶力、執(zhí)行功能等方面，見表2。

2.3 手術(shù)前后miR-24 相對表達(dá)量比較

頸動脈支架植入術(shù)后患者血清miR-24 相對表達(dá)量為(1.15±0.36)%，顯著高于術(shù)前(0.74±0.18)%(t=-7.023,P＜0.001)。

表2 頸動脈支架植入前后患者認(rèn)知功能評分比較 分

2.4 認(rèn)知功能變化與△miR-24 相關(guān)性分析

頸動脈支架植入術(shù)前后患者MoCA 變化值（△MoCA）、CDT 變 化 值（△CDT）、SDMT 變 化 值（△SDMT）、AVLT 變化值（△AVLT）、CFT 變化值（△CFT)、FAB 變 化 值（△FAB）、miR- 24 變 化 值（△miR-24），分別為（0.83±0.21）分、（0.25±0.05）分、（1.73±0.36）分、（0.75±0.24）分、（0.91±0.25）分、（0.66±0.19）分、（0.37±0.06）%；△miR-24 與△CDT、△SDMT、△CFT、△FAB 均呈正相關(guān)(r=0.582，P＜0.001；r=0.563，P＜0.001；r=400，P＜0.001；r=0.452，P＜0.001)(圖2)，與△MoCA、△AVLT 呈負(fù)相關(guān)(r=0.208，P=0.102；r=0.178，P=0.146)。

圖2 頸動脈狹窄患者認(rèn)知功能變化與△miR-24 相關(guān)性散點圖分析

2.5 認(rèn)知功能變化與△miR-24 多元線性回歸分析

將△CDT、△SDMT、△CFT、△FAB 作為自變量，α入=0.05，α入=0.1，納入多元線性回歸分析，結(jié)果顯示△miR-24 與△CDT、△SDMT、△CFT 呈正相關(guān)(P＜0.05)，與△FAB 呈負(fù)相關(guān)(P＞0.05)，見表3。

表3 認(rèn)知功能變化與△miR-24 多元線性回歸分析

3 討論

頸動脈狹窄作為動脈粥樣硬化發(fā)展的嚴(yán)重階段，是導(dǎo)致患者認(rèn)知功能損傷的主要原因之一。 有研究顯示，解除頸動脈狹窄可有效改善患者認(rèn)知功能，頸動脈支架植入術(shù)是臨床常用方法［17］。 頸動脈支架植入術(shù)改善認(rèn)知功能損傷的機制尚未完全明確。 miR-24 是miRNA 家族成員， 相關(guān)研究證實miR-24 在神經(jīng)元損傷中發(fā)揮重要作用［7］。 本研究實驗分析miR-24 與頸動脈狹窄患者認(rèn)知功能的關(guān)系，探討支架植入術(shù)改善患者認(rèn)知功能的可能機制。

本研究通過對不同狹窄程度患者miR-24 相對表達(dá)量進行比較，結(jié)果顯示隨著頸動脈狹窄程度升高，miR-24 相對表達(dá)量降低， 提示miR-24 與頸動脈狹窄患者病情存在聯(lián)系；通過比較頸動脈狹窄患者支架植入術(shù)前后認(rèn)知功能變化，發(fā)現(xiàn)支架植入術(shù)后患者總體認(rèn)知功能明顯改善， 主要體現(xiàn)在時間、空間定向概念、注意力、記憶力、執(zhí)行功能等方面，其原因可能與支架植入術(shù)改善腦血液循環(huán)、減輕缺血缺氧對腦組織損傷有關(guān)；進一步比較支架植入術(shù)前后頸動脈狹窄患者miR-24 相對表達(dá)量， 結(jié)果顯示支架植入術(shù)后患者血清miR-24 相對表達(dá)量升高。 基于以上結(jié)果，推測血清miR-24 可能與頸動脈狹窄患者認(rèn)知功能存在聯(lián)系。 為驗證推測，采用多元線性回歸分析miR-24 與認(rèn)知功能變化的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)△miR-24 與△CDT、△SDMT、△CFT 均呈正相關(guān)， 表明miR-24 相對表達(dá)量越高， 對患者時間、空間定向力、注意力及視覺空間感知能力的改善越有利。

miR-24 可抑制X-染色體連鎖凋亡抑制蛋白(X-chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)表達(dá)［18］，而XIAP 通過調(diào)節(jié)半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(caspase)-3 水平參與認(rèn)知功能損傷過程［19］。caspase-3 受到線粒體依賴的信號傳導(dǎo)通路激活，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，造成海馬區(qū)功能受損，破壞海馬區(qū)結(jié)構(gòu)完整性，進而影響空間學(xué)習(xí)及記憶能力等認(rèn)知功能［20］。 因此，本研究推測支架植入術(shù)可能是通過促進miR-24 表達(dá)改善頸動脈狹窄患者認(rèn)知功能。

本研究存在一定局限性， 如未將患者細(xì)分為單、雙側(cè)亞組進行分析，隨訪時間為6 個月雖避免了短期復(fù)查對學(xué)習(xí)和記憶造成的影響，但時間較短無法評估支架植入術(shù)對認(rèn)知功能的遠(yuǎn)期作用。 下一步將延長隨訪時間并進行基礎(chǔ)研究， 分析miR-24影響頸動脈狹窄患者認(rèn)知功能的病理生理機制。

綜上所述，頸動脈狹窄患者支架植入術(shù)后患者認(rèn)知功能明顯改善，主要體現(xiàn)在時間、空間定向力、注意力及視覺空間感知能力等方面，其機制可能與促進miR-24 表達(dá)有關(guān)。