王征宇， 相建峰， 彭志清， 陳 亮， 李萬斌， 王永利

隨著介入診療技術(shù)發(fā)展，碘對比劑更多地應(yīng)用于血管內(nèi)診治， 從而導(dǎo)致對比劑急性腎損傷（contrast-induced acute kidney injury，CI-AKI）發(fā)生。目前認(rèn)為CI-AKI 發(fā)病機(jī)制主要與腎血管收縮引起的腎缺血、腎小管直接毒性和腎小管細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)等因素有關(guān)［1-2］，但現(xiàn)有研究仍不能完全明確其發(fā)病機(jī)制和病理變化。 本研究通過血管介入技術(shù)構(gòu)建兔CI-AKI 模型，旨在觀察評估其腎功能改變、氧化應(yīng)激反應(yīng)、腎組織病理變化及其相關(guān)性，為臨床防治CI-AKI 提供實驗證據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗器械和試劑

4F 導(dǎo)管鞘（日本Terumo 公司），碘海醇（300mgI/mL，美國GE 公司），血清肌酐（sCr）和血清尿素氮（BUN）測試試劑盒（Olympus Diagnostica 愛爾蘭公司），丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）、細(xì)胞總抗氧化能力（TAC）、過氧化氫酶（CAT）及總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實驗動物

12 只健康、清潔、雄性新西蘭大白兔，2～3 個月齡，體重約2 500 g（由上海奉賢輝煌養(yǎng)殖場購入），予1 周適應(yīng)性分籠飼養(yǎng)，每籠1 只，提供足量飲水、標(biāo)準(zhǔn)兔食。 飼養(yǎng)環(huán)境良好，室溫20～25℃，相對濕度為45%～65%。 本實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，符合動物倫理要求。

1.3 兔CI-AKI 模型構(gòu)建

將實驗兔隨機(jī)分為4 組：12 h CI-AKI 組（n=3）、24 h CI-AKI 組（n=3）、48 h CI-AKI 組（n=3）和對照組（n=3），均在AXIOM Artis dTA DSA 系統(tǒng)（德國Siemens 公司）下進(jìn)行血管內(nèi)介入手術(shù)造模。 經(jīng)兔耳緣靜脈注射1.5%戊巴比妥鈉（1 mL/kg，初次劑量5 mL，隨后根據(jù)情況追加劑量）麻醉后，將兔置于導(dǎo)管床，鈍性分離左頸總動脈，采用改良Seldinger 技術(shù)逆行穿刺左頸總動脈成功后， 經(jīng)導(dǎo)絲引入4 F 導(dǎo)管鞘中擴(kuò)張管作為血管內(nèi)導(dǎo)管， 頭端位于腹主動脈上段，注入1～2 mL 碘海醇確認(rèn)雙腎動脈和腎實質(zhì)顯影，將導(dǎo)管固定； 各CI-AKI 組經(jīng)導(dǎo)管持續(xù)注入碘海醇，劑量為14 g/kg，總量約120 mL，對照組注入等量0.9%氯化鈉注射液，灌注時間均為30 min；灌注完畢拔除導(dǎo)管并結(jié)扎此頸總動脈， 局部縫合包扎，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.4 血液學(xué)和組織學(xué)標(biāo)本獲取

分別于術(shù)前1 h，術(shù)后1 h、2 h、12 h、24 h（24 h、48 h CI-AKI 組和對照組）和48 h（48 h CI-AKI 組和對照組）經(jīng)兔耳靜脈抽血10 mL，用于腎功能和氧化應(yīng)激反應(yīng)檢測。 分別于術(shù)后12 h（12 h CI-AKI 組）、24 h（24 h CI-AKI 組）、48 h（48 h CI-AKI 組和對照組），5%戊巴比妥鈉經(jīng)兔耳緣靜脈注射（5 mL/只）致安樂死，立即稱重并取下雙腎，左腎用于病理學(xué)檢查，右腎分離皮、髓質(zhì)后用于腎組織勻漿檢測。

1.5 實驗室檢查和組織病理學(xué)檢查

根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行sCr 和BUN 檢測， 同時檢測血液和腎皮質(zhì)、髓質(zhì)勻漿中MDA、MPO、TAC、CAT、T-SOD。

將各組兔腎臟標(biāo)本制成光鏡病理切片，分別采用蘇木精-伊紅（HE）、高碘酸-無色品紅（PAS）、過碘酸六胺銀（PASM）和Masson 染色法染色后進(jìn)行光鏡病理學(xué)檢查。 取48 h CI-AKI 組2 只和對照組1只兔腎臟標(biāo)本，制作電鏡病理切片，采用鈾鉛雙染色后進(jìn)行觀察。光鏡下對腎損傷病理變化程度進(jìn)行分級：0 級，無損傷；1 級，輕度損傷（＜25%）；2 級，中度損傷（25%～＜50%）；3 級，嚴(yán)重?fù)p傷（50%～75%）；4 級：非常嚴(yán)重?fù)p傷（＞75%）［3］。 資料采集和分析均由2 名有經(jīng)驗的專業(yè)病理醫(yī)師通過盲法進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述正態(tài)分布的定量資料，單因素方差分析比較各時間點組間各標(biāo)記物差異，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義的用LSD-t檢驗行兩兩比較，獨立樣本t檢驗比較兩組間定量資料分布差異，配對樣本t檢驗比較各組術(shù)后各時間點各標(biāo)記物與術(shù)前的差異，Pearson 相關(guān)分析比較各標(biāo)記物間相關(guān)性，Spearman 相關(guān)分析比較病理損傷與各標(biāo)記物間相關(guān)性，Kruskal-Wallis H 檢驗比較組間腎組織病理損傷程度差異， 組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義的用Mann-Whitney U 檢驗進(jìn)行兩兩比較。 本研究所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物一般情況

術(shù)后兔在籠中自然蘇醒，無死亡，活動自如，各CI-AKI 組兔精神萎靡，飲水和進(jìn)食較術(shù)前減少1/4～1/2，對照組兔精神狀態(tài)無明顯變化，飲水和進(jìn)食與術(shù)前基本一致。 術(shù)前各CI-AKI 組與對照組體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.366，P=0.722），術(shù)后各CI-AKI組體重較術(shù)前減輕，顯著低于對照組（t=-2.457，P=0.034），其中48 h CI-AKI 組術(shù)后體重較術(shù)前減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.500，P=0.032）。

2.2 手術(shù)前后腎功能變化

術(shù)前各CI-AKI 組sCr 和BUN 與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.512，P=0.620）。 各CI-AKI組術(shù)后1 h 時sCr 均顯著升高且高于對照組（P＜0.05），12 h 時升高均＞25%（表1）；BUN 高于對照組（P＜0.05）， 其中12 h CI-AKI 組、48 h CI-AKI 組術(shù)后BUN 均高于術(shù)前12 h CI-AKI 組。

表1 手術(shù)前后sCr 變化 μmol/L，±s

表1 手術(shù)前后sCr 變化 μmol/L，±s

*與術(shù)前比較，P＜0.05

組別 術(shù)前 術(shù)后1 h 術(shù)后2 h 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h 12 h CI-AKI 組（n=3） 80.00±5.57 105.67±14.01* 116.33±19.66* 148.33±14.98* — —24 h CI-AKI 組（n=3） 85.33±3.51 93.33±5.86* 104.00±7.21* 121.00±10.15* 137.00±11.14* —48 h CI-AKI 組（n=3） 89.00±5.20 98.67±5.03* 111.33±10.69 122.33±12.42* 135.33±17.62* 162.00±5.00*CI-AKI 組整體 84.78±5.74* 99.22±9.63* 110.56±12.92* 130.56±17.28* 136.17±13.21* 162.00±5.00*對照組（n=3） 83.00±2.00 83.00±3.00 85.33±2.52 80.33±2.52 82.33±2.08 82.00±2.65 t 值 0.512 2.792 5.548 4.862 6.784 24.495 P 值 0.620 0.019 ＜0.001 0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 手術(shù)前后血清和腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)記物變化

各CI-AKI 組血清MDA 術(shù)后1 h 較術(shù)前有所降低，術(shù)后2 h 后開始升高；血清MPO 術(shù)后1 h 即開始明顯升高； 血清TAC、CAT、T-SOD 術(shù)后1 h 即開始下降。 24 h CI-AKI 組、48 h CI-AKI 組術(shù)后血清MDA， 各CI-AKI 組術(shù)后MPO 均高于術(shù)前及對照組（P＜0.05）；12 h CI-AKI 組術(shù)后血清TAC， 各CI-AKI組術(shù)后血清CAT、T-SOD 均低于術(shù)前（P＜0.05），其中CAT 低于對照組（P＜0.05）。對照組術(shù)后各標(biāo)記物與術(shù)前差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各CI-AKI 組腎皮質(zhì)和髓質(zhì)勻漿MDA、MPO 均較對照組增高，TAC、CAT、T-SOD 均下降， 其中24 h CI-AKI 組、48 h CI-AKI 組MPO 均高于對照組（P＜0.05），各CI-AKI組腎髓質(zhì)勻漿各標(biāo)記物與對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 表2～5。

2.4 sCr、BUN 與氧化應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)記物變化相關(guān)性

sCr 與BUN，血清MDA、MPO，腎皮質(zhì)MPO，腎髓質(zhì)MDA、MPO 呈正相關(guān)，與腎髓質(zhì)T-SOD 呈負(fù)相關(guān)；BUN 與血清MDA、MPO 呈正相關(guān)， 與血清T-SOD 呈負(fù)相關(guān)。

2.5 術(shù)后腎組織病理改變

腎組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示， 各CI-AKI 組有嚴(yán)重的皮質(zhì)、髓質(zhì)近端腎小管損傷、較輕的皮質(zhì)遠(yuǎn)端腎小管損傷及輕度的腎小球損傷；對照組僅有輕度病理學(xué)改變，見圖1。 皮質(zhì)、髓質(zhì)近端腎小管損傷，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.680，P=0.021；χ2=10.866，P=0.012）， 各CI-AKI 組損傷均高于對照組（P＜0.05）。皮質(zhì)近端腎小管損傷與sCr，血清MDA、MPO，皮質(zhì)MPO，髓質(zhì)MDA、MPO 呈正相關(guān)，與血清CAT、髓質(zhì)T-SOD 呈負(fù)相關(guān)。 髓質(zhì)近端腎小管損傷與sCr，血清MDA、MPO，皮質(zhì)MPO，髓質(zhì)MDA 呈正相關(guān)，與血清、髓質(zhì)T-SOD 呈負(fù)相關(guān)。

表2 手術(shù)前后血清MDA 變化 nmol/mL，±s

表2 手術(shù)前后血清MDA 變化 nmol/mL，±s

*與術(shù)前比較，P＜0.05

組別 術(shù)前 術(shù)后1 h 術(shù)后2 h 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h 12 h CI-AKI 組（n=3） 2.24±0.07 1.93±0.23 3.39±1.17 5.14±1.32 — —24 h CI-AKI 組（n=3） 3.56±0.81 2.97±0.29 4.12±0.97 5.11±1.33* 5.50±0.84* —48 h CI-AKI 組（n=3） 3.10±0.95 2.88±1.18 3.60±1.44 4.63±0.65* 5.32±1.02 5.45±0.65*CI-AKI 組整體 2.97±0.85 2.59±0.79 3.70±1.10 4.96±1.02 5.41±0.84 5.45±0.65對照組（n=3） 2.75±0.92 2.85±0.77 2.75±0.35 2.45±1.13 2.45±0.90 3.25±0.57 t 值 0.385 -0.494 2.291 3.601 4.876 4.393 P 值 0.708 0.632 0.045 0.005 0.002 0.012

表3 手術(shù)前后血清MPO 變化 U/L，±s

表3 手術(shù)前后血清MPO 變化 U/L，±s

*與術(shù)前比較，P＜0.05

組別 術(shù)前 術(shù)后1 h 術(shù)后2 h 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h 12 h CI-AKI 組（n=3） 38.94±3.79 46.20±1.32* 52.05±6.65 66.10±13.22 — —24 h CI-AKI 組（n=3） 29.28±5.49 40.64±4.09 44.82±3.33 63.25±8.60* 66.21±3.00* —48 h CI-AKI 組（n=3） 39.25±5.94 49.82±17.63 49.58±19.16 63.59±9.29* 65.13±6.44* 79.05±2.30*CI-AKI 組整體 35.82±6.64 45.55±9.92 48.82±10.76 64.31±9.25 65.67±4.53 79.05±2.30對照組（n=3） 43.66±8.31 32.13±11.16 41.96±20.16 45.23±8.57 48.45±10.83 49.16±5.20 t 值 -1.680 1.978 0.779 3.139 3.509 9.098 P 值 0.124 0.076 0.454 0.011 0.010 0.001

表4 手術(shù)前后血清CAT 變化 U/mL，±s

表4 手術(shù)前后血清CAT 變化 U/mL，±s

*與術(shù)前比較，P＜0.05

組別 術(shù)前 術(shù)后1 h 術(shù)后2 h 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h 12 h CI-AKI 組（n=3） 10.81±1.01 6.90±2.94 5.61±2.64* 3.49±0.64* — —24 h CI-AKI 組（n=3） 4.74±2.17 2.74±2.04* 2.55±2.08* 0.79±0.42 0.54±0.09 —48 h CI-AKI 組（n=3） 11.16±3.13 9.50±2.90* 8.03±2.10* 6.65±0.96 4.29±0.71 3.42±1.06 CI-AKI 組整體 8.90±3.69 6.38±3.74 5.40±3.09 3.64±2.61 2.42±2.10 3.42±1.06對照組（n=3） 4.34±1.24 6.39±2.63 8.68±2.88 8.16±0.84 6.56±2.13 5.28±0.24 t 值 2.044 -0.004 -1.615 -2.863 -2.774 -2.962 P 值 0.068 0.997 0.137 0.017 0.028 0.087

表5 手術(shù)前后血清T-SOD 變化 U/mL，±s

表5 手術(shù)前后血清T-SOD 變化 U/mL，±s

*與術(shù)前比較，P＜0.05

組別 術(shù)前 術(shù)后1 h 術(shù)后2 h 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h 12 h CI-AKI 組（n=3） 457.02±21.84 401.89±16.90* 322.83±85.38 257.33±62.80* — —24 h CI-AKI 組（n=3） 533.60±36.09 501.45±36.90* 460.78±15.37* 444.79±37.97 413.33±14.69 —48 h CI-AKI 組（n=3） 510.87±42.85 485.86±52.76* 469.55±50.67* 462.90±53.45* 430.80±80.62 417.50±71.10*CI-AKI 組整體 500.50±45.43 463.07±57.08 417.72±87.19 388.34±108.52 422.07±52.70 417.50±71.10對照組（n=3） 477.57±8.80 468.94±27.82 489.43±29.33 471.96±40.94 463.54±16.11 501.28±37.45 t 值 1.435 -0.168 -1.360 -1.270 -1.293 -1.806 P 值 0.184 0.870 0.204 0.233 0.237 0.145

3 討論

目前文獻(xiàn)報道的CI-AKI 動物實驗多來自大鼠模型，但在嚙齒類動物中，兔腎臟形態(tài)學(xué)表現(xiàn)與人體更接近［3］。 據(jù)文獻(xiàn)報道，單次注射含碘對比劑5 g/kg即可在兔體內(nèi)誘導(dǎo)CI-AKI 發(fā)生， 而在大鼠和小鼠體內(nèi)卻不會引起明顯腎損傷［4-5］，因此兔更適合構(gòu)建CI-AKI 模型［6］。 既往研究中基本采用外周靜脈注射方式， 多聯(lián)合應(yīng)用脫水或腎毒性藥物共同誘導(dǎo)CI-AKI 發(fā)生［7］，但不一定能真實反映經(jīng)導(dǎo)管血管內(nèi)治療中CI-AKI 發(fā)生情況及病理生理變化。 因此，本研究采用血管內(nèi)介入技術(shù)制作兔CI-AKI 模型，經(jīng)頸動脈入路操作較為簡便，且對比劑可隨血流方向進(jìn)入雙側(cè)腎動脈，更容易造模成功。 由于目前尚無動物CI-AKI 診斷標(biāo)準(zhǔn)， 本研究參考了臨床最常用且比較公認(rèn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)： 應(yīng)用對比劑48～72 h 內(nèi)sCr 增加44 μmol/L 或較基礎(chǔ)值升高＞25%，并排除其他腎功能損害［8］。 本研究中各CI-AKI 組實驗兔在12 h 時sCr 水平均升高＞25%并具有統(tǒng)計學(xué)意義，且sCr 和BUN 變化水平顯著高于對照組；腎功能改變結(jié)合臨床表現(xiàn)證實，模型組兔在對比劑應(yīng)用后12 h 均發(fā)生CI-AKI，表明血管介入技術(shù)可構(gòu)建CI-AKI動物模型。

圖1 兔CI-AKI 模型構(gòu)建后腎組織病理改變

MDA、MPO 作為氧化應(yīng)激反應(yīng)終產(chǎn)物， 過量生成會導(dǎo)致氧化性組織損傷，CAT、T-SOD 作為體內(nèi)主要抗氧化酶，分解活性氧，避免自由基對人體細(xì)胞的氧化損傷，而TAC 可反映血漿和體內(nèi)所有抗氧化劑總的作用［9-10］。本研究中各CI-AKI 組血清MDA 在術(shù)后1 h 有一過性下降， 提示氧化應(yīng)激反應(yīng)初期兔抗氧化能力較強(qiáng)，可抑制血清MDA 形成，但隨著氧自由基增加，氧化應(yīng)激系統(tǒng)失代償，因而在2 h 開始明顯升高。MPO 升高和CAT、T-SOD、TAC 下降提示抗氧化酶過度消耗，兔總體抗氧化能力降低，結(jié)合腎組織勻漿標(biāo)記物變化， 表明氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，體內(nèi)活性氧自由基過量產(chǎn)生導(dǎo)致腎損傷［10-11］。同時，各CI-AKI 組sCr、BUN 升高與氧化應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)記物變化顯著相關(guān)。 因此，氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生和加重與腎功能損害一致，即在血管介入診療中，強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致CI-AKI 發(fā)生。

藥物性腎損傷包括急性腎小管壞死和急性間質(zhì)性腎炎，病理上主要表現(xiàn)為近端腎小管損傷和腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤。本研究中兔CI-AKI 模型病理表現(xiàn)為皮質(zhì)和髓質(zhì)近端腎小管損傷、 皮質(zhì)遠(yuǎn)端腎小管程度較輕損傷、腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤及線粒體破壞，符合藥物性急性腎損傷表現(xiàn)。 電鏡下可看到腎小球有一定程度損傷，但與CI-AKI 是否直接相關(guān)尚不能確定。 腎間質(zhì)無明顯纖維化提示，對比劑導(dǎo)致的腎損傷為急性病理改變。 因此，實驗兔經(jīng)動脈注入對比劑后造成了比較嚴(yán)重的急性腎損傷，其病理變化與sCr、氧化應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)記物顯著相關(guān)。 目前認(rèn)為，近端腎小管比遠(yuǎn)端腎小管更容易發(fā)生缺血和毒性物質(zhì)損傷的主要原因，在于其產(chǎn)生無氧糖酵解三磷酸腺苷能力較低，缺乏抗氧化劑和抗凋亡蛋白并對線粒體毒性更加敏感［12-14］。 腎小管細(xì)胞接觸對比劑后受到外來毒性刺激并發(fā)生缺血、缺氧，線粒體發(fā)生腫脹、分裂和線粒體吞噬，以減少對腎小管的損害［15］，線粒體功能受損并產(chǎn)生更多活性氧自由基，導(dǎo)致凋亡［16-17］。因此，本研究在電鏡下觀察到近端腎小管明顯的線粒體損傷表現(xiàn)，并可觀察到用于清除損傷線粒體的自噬體增多。

本研究不足之處乃樣本量較小，且應(yīng)用了較高劑量對比劑，因而達(dá)到100%造模成功，這是預(yù)實驗中所用劑量12 g/kg 時sCr 升高未達(dá)到25%以上的緣故。 進(jìn)一步實驗中會擴(kuò)大樣本量，并盡量減少對比劑用量，以更接近臨床實際情況觀察動物模型腎損傷發(fā)生。

總之，采用血管介入法經(jīng)動脈插管注入對比劑可成功構(gòu)建CI-AKI 兔模型， 其存在明顯的腎功能減退、氧化應(yīng)激反應(yīng)和腎損傷病理改變。 氧化應(yīng)激反應(yīng)和腎臟病變與碘對比劑所致腎功能損害直接相關(guān)。