彭孝春， 陸 霜， 柳 揚， 顧福嘉

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤，據(jù)報道全世界每年約有75 萬新發(fā)病例［1］。根治性切除術(shù)為治療肝癌的首選方法，但肝癌起病隱匿，早期較難覺察，多數(shù)患者確診時已為中晚期，因此喪失根治性切除治療的機會［2-3］。 而部分肝癌患者對化療藥物不耐受，導致治療中斷［4-5］，因此急需尋找安全便捷、療效確切的方法用于肝癌患者的治療。 射頻消融術(shù)（radiofrequency ablation，RFA）因具有安全、創(chuàng)傷小、操作簡單、術(shù)后并發(fā)癥少的優(yōu)點，在肝癌的治療中得到廣泛認可［6-7］。 RFA 能改善肝癌患者生活質(zhì)量，提高患者生存率，然而術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)對患者的長期生存造成嚴重影響，預(yù)后情況仍不樂觀［8］。及早預(yù)測肝癌患者預(yù)后對制定有效措施改善患者預(yù)后具有重要意義。 但目前臨床尚無用于預(yù)測肝癌患者預(yù)后的準確、靈敏的標記物。 因此臨床亟需探尋準確、敏感的生物學標記物評估肝癌患者預(yù)后。 長非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度超過200 個核苷酸的新型非編碼RNA［9］，已有研究證實多種lncRNA 參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程［10-11］。Cui等［12］通過測序及微陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA LINC00205（long non-coding RNA LINC00205，LncRNA LINC00205）在肝癌組織中異常表達。 本研究冀為臨床預(yù)測肝癌患者預(yù)后情況提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

前瞻性選取2016 年1 月至2018 年9 月在貴州省人民醫(yī)院接受治療的135 例肝癌患者作為研究對象。 參照《原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治專家共識》［13］中關(guān)于肝癌診斷的內(nèi)容對疑似肝癌患者進行診斷。納入標準： ①經(jīng)病理活檢確診為肝癌且為初次確診；②美國東部腫瘤協(xié)作組（eastern cooperative oncology group，ECOG）活動狀態(tài)評分＜1 分；③近期未接受化療、放療、靶向治療及免疫治療等抗腫瘤治療；④巴塞羅那分期（Barcelona Clinic Liver Cancer）A 期；⑤病灶數(shù)目≤3 個；⑥腫瘤直徑≤5 cm；⑦簽署知情同意書。 排除標準：①合并其他部位腫瘤；②穿刺部位皮膚潰破；③妊娠期及哺乳期婦女；④嚴重心、腎、肺等功能不全者；⑤肝功能Child-Pugh C 級；⑥有嚴重出血傾向者；⑦大量腹腔積液；⑧腫瘤病灶鄰近脈管或主要大血管；⑨隨訪失聯(lián)者。 135 例肝癌患者男88 例，女47 例，年齡42～79 歲，平均（65.0±6.5）歲。根據(jù)患者是否復(fù)發(fā)將患者分為復(fù)發(fā)組（n=49）和未復(fù)發(fā)組（n=86）。 本研究獲得本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 RFA 治療 患者于術(shù)前行血常規(guī)、肝腎功能及影像學檢查。 術(shù)中密切監(jiān)測心電圖、血壓、呼吸等生命體征。 患者在接受RFA 治療前保持空腹4～6 h，全身靜脈麻醉，采用超聲確定病灶的位置、穿刺方向、角度及進針深度。2%利多卡因局麻，以實時超聲透視下將Chiba 針為導引針刺入病灶， 將射頻電極針沿導引針方向進入病灶。 根據(jù)病灶大小、位置設(shè)定消融參數(shù)：瘤體直徑＜3 cm，溫度90～110℃，時間20～30 min。 消融結(jié)束后退針并消融針道，術(shù)中超聲造影復(fù)查消融結(jié)果，確定有無腫瘤殘余及肝包膜下出血、氣胸等癥狀。 消融過程中，實時動態(tài)觀察，確認導引針和消融針位置及方向正確。

1.2.2 血清學指標檢測 抽取肝癌患者RFA 術(shù)后12 h 空腹外周靜脈血10 mL，室溫下4 000 r/min 離心10 min，分離上層血清，置于-80℃冰箱，待測。 采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測肝癌患者血清LncRNA LINC00205 相對表達量。 Trizol 試劑提取的血清中的總RNA， 將2 μg 的總RNA 添加至20 μL 反應(yīng)液中， 采用Tianscript RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京天根生化科技有限公司）反向轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 最后PCR 擴增。 反應(yīng)條件為：94℃10 min，94℃45 s，60℃45 s，72℃45 s，40 個循環(huán)。LncRNA LINC00205 正 向：5'- CCCTGGAGTCGGTGCTAAA TAC-3'， 反向：5'-TAGACTAGTGAGGGGGGCA-3'。β- actin 正 向：5’- UAGCUUAUCAGACUGAUGUU GA-3’，反向：5’-GTCAGTCGCTTGGGCTGT-3’。以βactin 為內(nèi)參， 采用2-ΔΔCt表示LncRNA LINC00205 相對表達量。

1.2.3 隨訪 采用復(fù)診的方式對患者進行為期12個月的隨訪，了解患者復(fù)發(fā)情況，所有患者出院后均規(guī)律隨訪，每月檢測甲胎蛋白、癌胚抗原、CA19-9等腫瘤標志物，術(shù)后6 個月每個月復(fù)查1 次，其后每3 個月復(fù)查1 次。 采用超聲造影或增強CT 復(fù)查，如影像學檢查在肝內(nèi)發(fā)現(xiàn)新病灶則經(jīng)病理活檢確診。 隨訪起始時間為2017 年1 月17 日，截止時間為2019 年9 月23 日，中位隨訪時間為9 個月。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。 服從正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。 計數(shù)資料用例或率［n（%）］表示，采用卡方檢驗。 用受試者工作特征（ROC）曲線分析LncRNA LINC00205 評估肝癌患者預(yù)后的價值。 采用Kaplan-Meier 及Cox 單因素及多因素回歸分析影響肝癌患者預(yù)后的相關(guān)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較

135 例肝癌患者隨訪期間復(fù)發(fā)49 例（36.3%）。兩組在年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、HbsAg、ASA 分級、病灶位置方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在腫瘤直徑、分化程度，血清AFP、白蛋白、總膽紅素方面比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見表1。

2.2 血清LncRNA LINC00205 評估肝癌患者預(yù)后的效能

復(fù)發(fā)組患者血清LncRNA LINC00205 相對表達量為（3.52±0.81），高于未復(fù)發(fā)組（3.19±0.78），差異有統(tǒng)計學意義（t=2.331，P=0.021）。 血清LncRNA LINC00205 評估肝癌患者復(fù)發(fā)的受試者工作特征（ROC）曲線的曲線下面積（AUC）、靈敏度、特異度、最佳截斷點分別為0.825（95%CI：0.750～0.885）、83.67%、55.28%、3.04。 見圖1。

2.3 血清LncRNA LINC00205 與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)血清LncRNA LINC00205 評估肝癌患者復(fù)發(fā)的最佳截斷點（3.04）將患者分為高LncRNA LINC00205組（LncRNA LINC00205≥3.04，n=71）和低LncRNA LINC00205 組（LncRNA LINC00205＜3.04，n=64）。高LncRNA LINC00205 組復(fù)發(fā)率為52.11%（37/71），高于低LncRNA LINC00205 組的18.75%（12/64），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.986，P=0.026）。 高LncRNA LINC00205 組患者中位生存時間為11 個月，低于低LncRNA LINC00205 組的12 個月，差異有統(tǒng)計學意義（Log Rank Chi-square=14.361，P＜0.001）。 見圖2。

表1 兩組基線資料比較 ±s，n（%）

表1 兩組基線資料比較 ±s，n（%）

因素 復(fù)發(fā)組（n=49）未復(fù)發(fā)組（n=86） t/χ2 值 P 值年齡/歲 65.9±6.8 64.5±6.4 1.242 0.216性別/n（%） 0.532 0.466男30（61.2） 58（67.4）女19（38.8） 28（32.6）體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2） 22.83±3.18 23.35±3.26 0.899 0.370 HBsAg/n（%） 0.503 0.478陰性 11（22.5） 15（17.4）陽性 38（77.6） 71（82.6）腫瘤直徑/n（%） 8.991 0.003≥3 cm 23（46.9） 19（22.1）＜3 cm 26（53.1） 67（77.9）AFP/n（%） 3.897 0.048≥400 μg/L 28（57.1） 34（39.5）＜400 μg/L 21（42.9） 52（60.5）ASA 分級/n（%） 0.859 0.354Ⅰ～Ⅱ 33（67.4） 51（59.3）Ⅲ14（32.7） 35（40.7）病灶位置/n（%） 0.348 0.555單側(cè) 30（61.2） 57（66.3）雙側(cè) 19（38.8） 29（33.7）分化程度/n（%） 5.358 0.021高、中分化 15（30.6） 44（51.2）低分化 34（69.4） 42（48.8）白蛋白/（g/L） 43.62±4.74 36.08±4.21 9.555 ＜0.001總膽紅素/（μmol/L） 41.73±4.52 34.83±4.15 8.992 ＜0.001

圖1 血清LncRNA LINC00205 評估肝癌患者復(fù)發(fā)的ROC 曲線

2.4 影響肝癌患者預(yù)后的因素

將年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、HbsAg、腫瘤直徑、AFP、ASA 分級、病灶位置、分化程度、白蛋白、總膽紅素及LncRNA LINC00205 作為自變量，將肝癌患者預(yù)后情況作為因變量納入Cox 單因素回歸分析，結(jié)果顯示腫瘤直徑、 分化程及LncRNA LINC00205可能與肝癌患者復(fù)發(fā)存在聯(lián)系。按納入標準α≤0.10，將上述因素納入Cox 多因素分析，結(jié)果顯示分化程度及LncRNA LINC00205 與肝癌患者復(fù)發(fā)密切相關(guān)。（表2，表3）

圖2 血清LncRNA LINC00205 與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

表2 賦值情況

表3 影響肝癌患者預(yù)后的因素

3 討論

近年來，RFA 治療在治療肝癌方面取得一定的療效，然而，由于肝癌具有血供豐富、浸潤性生長的特點導致RFA 在治療肝癌時可能發(fā)生癌細胞殘留，影響患者預(yù)后情況［14-16］。 因此需探尋可用于肝癌患者預(yù)后評估的指標。目前，關(guān)于LncRNA LINC00205在腫瘤中的作用已有初步研究， 有證據(jù)表明，LncRNA LINC00205 在肝癌組織中異常表達［12］。 但關(guān)于LncRNA LINC00205 與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系尚未可知，因此本研究就LncRNA LINC00205 與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系進行探討。

本研究通過對肝癌患者進行為期12 個月的隨訪，了解患者預(yù)后情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)135 例患者12 個月內(nèi)復(fù)發(fā)率約為36.30%，與施顯茂等［17］研究結(jié)果相近。 本課題同時比較不同預(yù)后患者血清LncRNA LINC00205 相對表達量， 結(jié)果提示檢測血清LncRNA LINC00205 有助于評估肝癌患者復(fù)發(fā)情況。 由此構(gòu)建了血清LncRNA LINC00205 評估肝癌患者復(fù)發(fā)的ROC 曲線，表明血清LncRNA LINC00205評估肝癌患者復(fù)發(fā)的效能較高；高LncRNA LINC00205組患者復(fù)發(fā)率高于低LncRNA LINC00205 組、中位生存時間低于低LncRNA LINC00205 組，表明血清LncRNA LINC00205 可能與肝癌患者復(fù)發(fā)相關(guān)。 肝癌復(fù)發(fā)情況受多種因素影響，采用Cox 單因素及多因素回歸分析影響肝癌患者復(fù)發(fā)的因素，結(jié)果顯示分化程度與肝癌患者復(fù)發(fā)密切相關(guān)， 結(jié)果與Murakami 等［18］研究相符。 此外，本研究結(jié)果顯示LncRNA LINC00205 與肝癌患者復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

基礎(chǔ)研究表明，敲除LncRNA LINC00205 基因后，miR-122-5p 表達量明顯升高， 兩者呈競爭性抑制的關(guān)系［19］。 微RNA-122-5p（microRNA-122-5p，miR-122-5p）與肝癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［20］。miR-122-5p 主要在肝臟中表達，參與肝臟多個生理學過程，如應(yīng)激反應(yīng)和脂質(zhì)代謝過程［21-22］。 miR-122-5p可通過調(diào)節(jié)SRF 蛋白介導的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲［23］。 此外，miR-122-5p 的過表達可降低B 細胞淋巴因子-w 和細胞周期蛋白cyclin G1 的表達，進而觸發(fā)癌細胞的細胞周期停滯并導致癌細胞凋亡［24］。 因此筆者推測LncRNA LINC00205 可能通過調(diào)節(jié)miR-122-5p 的表達參與肝癌的疾病進程。

本研究存在一定不足，僅測定了一個時間點的LncRNA LINC00205 表達情況，且未進行基礎(chǔ)研究。下一步將動態(tài)監(jiān)測LncRNA LINC00205 表達情況并進行基礎(chǔ)研究，分析LncRNA LINC00205 影響肝癌患者預(yù)后的病理生理機制。

綜上所述，檢測血清LncRNA LINC00205 表達情況有助于評估肝癌患者預(yù)后情況。