潘楊軍， 王 耀， 章喜林， 陸偉杰， 鄭銀元

肝細(xì)胞肝癌（HCC）血供豐富，90%以上血供來自于肝動脈［1］。 TACE 已被公認(rèn)為治療HCC 的有效手段之一［2］。 有報道顯示，相同腫瘤分期的HCC 患者接受TACE 治療，但療效不盡相同［3］。篩選適合接受TACE 治療的HCC 患者可有效降低醫(yī)療成本，達(dá)到精準(zhǔn)醫(yī)療的目的。 因此，探尋靈敏度和特異度均較高的生物標(biāo)志物評價HCC 患者TACE 療效具有重要意義。

硫氧還蛋白9（thioredoxin domain containing protein 9，TXNDC9）是一種具有ATP 結(jié)合蛋白活性的硫氧還蛋白［4］。 有研究表明敲除TXNDC9 基因可抑制MYC 與染色質(zhì)結(jié)合［5］，從而抑制HCC 細(xì)胞生長。 此外，TXNDC9 還可通過靶向核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor-E2 related factor2，Nrf2）調(diào)節(jié)自噬，從而減弱大腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑的靈敏度［6］。從而推測，HCC 組織中TXNDC9 水平能反映TACE 療效，遂開展本研究，以期為HCC 患者選擇合適的治療方案提供參考。 現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 入選患者臨床資料

選擇2013 年1 月至2016 年1 月診斷為HCC的97 例患者作為研究對象。 根據(jù)《原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治專家共識》［7］診斷HCC 并進(jìn)行治療。 納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～70 歲；②病理活檢確診為HCC；③接受TACE 治療；④Child-Pugh 分級A 或B；⑤能配合完成相關(guān)檢查及隨訪； ⑥簽署了知情同意書；⑦有保存在液氮罐中完好的腫瘤組織（經(jīng)皮穿刺活檢獲取）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①TACE 治療禁忌證；②腫瘤分期Ⅲb 期或Ⅳ期患者；③美國東部協(xié)作組（ECOG）評分高于2 分；④接受射頻消融術(shù)、微波消融術(shù)或靶向藥物治療等。 收集患者年齡、性別、乙肝表面抗原（HBsAg）、Child-Pugh 分級、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、甲胎蛋白（AFP）等臨床資料。 97 例HCC 患者中男性66 例，女性31 例，年齡51～70 歲，平均年齡（62.6±5.3）歲。 本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 TACE 治療 ①術(shù)前常規(guī)檢查患者肝、腎功能、血常規(guī)、尿常規(guī)、凝血功能及心電圖等。 ②根據(jù)HCC 患者腫瘤位置確定手術(shù)姿勢，常規(guī)消毒、鋪巾，行局部麻醉。 采用Seldinger 改良法經(jīng)股動脈置入導(dǎo)管鞘， 將其插管至肝總動脈或腹腔動脈處，行腫瘤病灶血管造影，了解其血供情況。了解清楚腫瘤病灶供血情況后將表柔比星、奧沙利鉑和超液化碘油的混懸液灌注至腫瘤供血動脈。 術(shù)中根據(jù)腫瘤病灶血供及大小決定乳化劑的用量，確保完全栓塞腫瘤供血動脈。③術(shù)后密切觀察患者有無TACE 并發(fā)癥發(fā)生，若出現(xiàn)發(fā)熱、肝區(qū)悶痛、惡心等，則給予對癥處理。 針對TACE治療療效較差的患者，根據(jù)患者病情給予針對性治療。

1.2.2 HCC 組織中TXNDC9 水平檢測 用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測HCC 組織中TXNDC9 水平［8］。實(shí)驗(yàn)步驟：①滴加RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，4℃4 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，提取上層清液；②用BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量；③80 V 凝膠電泳15 min，然后增加電壓至120 V，直至溴酚藍(lán)跑出膠 面； ④300 mA 轉(zhuǎn) 膜60 min； ⑤滴 加 兔 抗 人TXNDC9 單克隆抗體，4℃孵育過夜， 第2 日滴加二抗，室溫孵育1 h；⑥用ELC 電化學(xué)發(fā)光曝光顯影，最后用Image J 軟件分析結(jié)果。 本實(shí)驗(yàn)所用抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 TACE 治療療效評價 用實(shí)體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)的修訂標(biāo)準(zhǔn)（mRECIST）［9］評價首次TACE 治療的療效。完全緩解（CR）為CT 或MRI 檢查所有目標(biāo)病灶內(nèi)動脈期無增強(qiáng)顯影；部分緩解（PR）為CT 或MRI檢查目標(biāo)病灶的直徑總和降低30%；疾病穩(wěn)定（SD）為CT 或MRI 檢查目標(biāo)病灶的直徑總和降低（未達(dá)到PR 標(biāo)準(zhǔn)）或升高程度低于20%；疾病進(jìn)展（PD）為CT 或MRI 檢查目標(biāo)病灶的直徑總和升高20%或有新病灶出現(xiàn)。

1.2.4 隨訪 于出院后1 個月復(fù)查CT 或MRI，了解HCC 患者碘油沉積情況、 腫塊體積變化及有無新腫瘤病灶等。 第2 次及以后隨訪采用電話方式了解HCC 患者5 年生存預(yù)后情況。 每月隨訪1 次，末次隨訪時間為2020 年2 月16 日，平均隨訪時間為43.74（6～60）個月。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，四組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用S-N-K 檢驗(yàn)。 計數(shù)資料用例或率［n（%）］表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。用Spearman 相關(guān)分析TXNDC9 水平與TACE治療療效的關(guān)系。 用受試者工作特征（ROC）曲線下面積（AUC）評價TXNDC9 診斷HCC 預(yù)后的效能。 用Kaplan-Meier 繪制TXNDC9≥0.94 和TXNDC9＜0.94的HCC 患者生存曲線，用Log-Rank 法比較差異。用Cox 回歸分析影響HCC 患者預(yù)后的因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組基線資料

97 例HCC 患者首次接受TACE 治療后，17 例（17.53%）CR，30 例（30.93%）PR，21 例（21.65%）SD，29 例（29.90%）PD。四組在年齡、性別、HBsAg、Child-Pugh 分級、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑和AFP 方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），見表1。

表1 各組基線資料比較 n（%）

2.2 HCC 患者TACE 療效與TXNDC9 的關(guān)系

CR 組、PR 組、SD 組 和PD 組HCC 組 織 中TXNDC9 水平分別為0.66±0.09、0.75±0.09、0.94±0.12 和1.08±0.11，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（F=77.815，P＜0.001）。CR 組TXNDC9 水平低于PR 組、SD 組和PD 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（q=3.933、11.655、18.501，P＜0.05）。PR 組TXNDC9 水平低于SD 組和PD 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（q=9.167、17.117，P＜0.05）。 SD 組TXNDC9水平低于PD 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q=6.453，P＜0.05）。HCC 組織中TXNDC9 水平與TACE 治療療效呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（rs=-0.849，P＜0.001）。

2.3 HCC 預(yù)后與TXNDC9 的關(guān)系

97 例HCC 患者1 年、3 年和5 年生存率分別為84.5%（82/97）、68.0%（66/97）和52.6%（51/97）。TXNDC9 診斷HCC 預(yù)后的ROC AUC 為0.930（95%CI：0.859～0.972），最大約登指數(shù)為0.700，其 所對應(yīng)的最佳截斷點(diǎn)、靈敏度和特異度分別為0.9、73.9%和96.1%，見圖1。以TXNDC9 診斷HCC 預(yù)后的最佳截斷點(diǎn)為界，將HCC 患者分為兩組：TXNDC9≥0.94 組（n=37）和TXNDC9＜0.94 組（n=60）。TXNDC9≥0.94 組中位生存時間低于TXNDC9＜0.94 組（24個月比60 個月），差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（Log-Rank Chi-square=64.538，P＜0.001），見圖2。

圖1 TXNDC9 診斷HCC 預(yù)后的ROC 曲線

2.4 影響HCC 預(yù)后的因素分析

將HCC 患者預(yù)后（生存=0，死亡=1）作為因變量，將年齡、性別（女=0，男=1）、HBsAg（－=0，＋=1）、Child-Pugh 分級（A=0，B=1）、腫瘤數(shù)目（1 個=0，≥2個=1）、腫瘤直徑、AFP 和TXNDC9 作為自變量納入單因素Cox 回歸分析， 結(jié)果顯示腫瘤直徑、Child-Pugh 分級和TXNDC9 與HCC 預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。將年齡、腫瘤直徑、Child-Pugh 分級和TXNDC9 作為自變量（納入標(biāo)準(zhǔn)P≤0.1），將HCC 患者預(yù)后作為因變量納入多因素Cox 回歸分析，結(jié)果顯示腫瘤直徑、Child-Pugh 分級和TXNDC9 是HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素（P＜0.05），見表2。

圖2 不同TXNDC9 水平HCC 患者生存曲線

3 討論

目前，臨床多采用CT 或MRI 等影像學(xué)檢查手段了解TACE 治療后碘油沉積及腫瘤體積變化等情況評價TACE 治療效果。 但CT 或MRI 等影像學(xué)檢查費(fèi)用較貴， 多次復(fù)查了解HCC 病灶變化會增加患者輻射和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，需探尋一種準(zhǔn)確率高且檢查費(fèi)用低的生物標(biāo)志物評價TACE 治療療效。 有學(xué)者用平均血小板容積評價TACE 治療HCC 的療效，結(jié)果顯示TACE 術(shù)前及術(shù)后平均血小板容積值的變化在TACE 術(shù)后療效評估方面有一定價值［10］。 但對于骨髓造血功能異常的HCC 患者而言， 平均血小板容積值異常，用其評價TACE 術(shù)后療效的準(zhǔn)確度會大大降低。 此外，化療藥物也會對骨髓造血功能有一定影響，進(jìn)而影響平均血小板容積值，因此，單純用平均血小板容積評價TACE 治療療效不適用于合并全身化療或有造血功能異常的HCC 患者。 此外，還有學(xué)者用血清白細(xì)胞介素-6 和γ 谷氨酰轉(zhuǎn)移酶評價TACE 治療療效，結(jié)果顯示二者聯(lián)合對TACE 治療療效及預(yù)后評價的價值較高［11］。 白細(xì)胞介素-6 在炎癥性疾病中高表達(dá)，γ 谷氨酰轉(zhuǎn)移酶在肝纖維化中表達(dá)異常，因此，對于合并炎癥性疾病或肝纖維化的HCC 患者， 采用白細(xì)胞介素-6 和γ 谷氨酰轉(zhuǎn)移酶評價TACE 治療療效， 其準(zhǔn)確性有待考證。

表2 影響HCC 患者預(yù)后的因素分析

TXNDC9是硫氧還蛋白家族中成員， 在抗氧化應(yīng)激損傷中具有重要作用［12］。 目前，已有研究證實(shí)TXNDC9 在 前 列 腺 癌［13］、肝 細(xì) 胞 癌［5］和 大 腸 癌［14］中高表達(dá)，并參與腫瘤進(jìn)展。 癌細(xì)胞自噬水平已被證實(shí)與化療耐藥密切相關(guān)［15-17］。干擾TXNDC9 表達(dá)，大腸癌細(xì)胞中Nrf2 水平也隨之降低，進(jìn)而阻斷了細(xì)胞自噬過程，同時細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平升高，在奧沙利鉑誘導(dǎo)下凋亡［6］。 筆者推測HCC 細(xì)胞也通過TXNDC9/Nrf2 通路調(diào)控自噬水平，進(jìn)而下調(diào)對化療藥物的靈敏度。 檢測HCC 組織中TXNDC9 可反映TACE 治療療效。

本研究通過比較CR 組、PR 組、SD 組和PD 組HCC 組織中TXNDC9 水平，結(jié)果顯示其水平依次升高， 此外，HCC 組織中TXNDC9 水平與TACE 治療療效呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。 上述結(jié)果證實(shí)了課題組推測，HCC 組織中TXNDC9 水平能反映TACE 治療療效。為進(jìn)一步分析HCC 組織中TXNDC9 水平與TACE治療遠(yuǎn)期療效的關(guān)系， 本課題對接受TACE 治療的HCC 患者進(jìn)行了隨訪，結(jié)果顯示其1 年、3 年和5 年生存率分別為84.54%、68.04%和52.58%，與伏旭等［18］隨訪結(jié)果接近。 構(gòu)建TXNDC9 診斷HCC預(yù)后的ROC 曲線，結(jié)果顯示其ROC AUC、靈敏度和特異度分別為0.930、73.91%和96.08%，該結(jié)果提示TXNDC9 對HCC 預(yù)后評估有極高價值，但靈敏度較低，可輔助評價HCC 患者預(yù)后。 進(jìn)一步采用單因素和多因素Cox 回歸分析影響HCC 患者預(yù)后的因素，結(jié)果顯示腫瘤直徑、Child-Pugh 分級和TXNDC9是HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素。 張長坤等［19］、劉光華等［20］研究表明，伴隨HCC 腫瘤直徑增加和Child-Pugh 分級增高， 患者預(yù)后不良風(fēng)險也隨之增加。 推測HCC 組織中TXNDC9 水平高，表明癌細(xì)胞調(diào)節(jié)自噬的能力強(qiáng)， 進(jìn)而對化療藥物靈敏度降低，檢測HCC 組織中TXNDC9 水平可反映癌細(xì)胞自噬水平，進(jìn)而反映TACE 治療療效。

綜上所述，HCC 組織中TXNDC9 水平高， 提示患者接受TACE 治療療效較差，獲益較低。 此外，高TXNDC9 水平還表明HCC 患者預(yù)后不良風(fēng)險較高。檢測HCC 組織中TXNDC9 水平可輔助評價TACE治療療效及遠(yuǎn)期預(yù)后。 課題組下一步將開展基礎(chǔ)研究，闡明TXNDC9 與化療靈敏度的關(guān)系。