賁蓓倍,徐維紅,鄒德玉,牟美睿,楊仁杰,劉海學

(1.天津農(nóng)學院，天津 300384;2.天津市植物保護研究所，天津 300112)

肥料是影響農(nóng)作物代謝過程的重要因素[1]。有研究表明，肥料能讓小麥在生育期間保持較高的光合水平[2]，優(yōu)化冠層結(jié)構(gòu)[3]，使碳化合物積累量增加，并促使同化產(chǎn)物向穗部轉(zhuǎn)運[4]，最終對籽粒中代謝物的含量和類型產(chǎn)生影響。氮肥是影響小麥生長發(fā)育的首要養(yǎng)分因子。孫麗敏等[5]發(fā)現(xiàn)，氮肥對4個類型生態(tài)區(qū)冬小麥產(chǎn)量效應最大。小麥蛋白質(zhì)和淀粉的合成代謝在受氮影響顯著[6]。目前，在小麥生產(chǎn)過程中存在濫用氮肥、氮肥利用率下降、施肥不合理等現(xiàn)象[7-8]，加之氮肥種類眾多[9-10]，使農(nóng)戶難以抉擇。合理的氮肥運籌對小麥生產(chǎn)極為重要。

代謝組學是一門新興學科，主要是通過生物體受到環(huán)境影響后小分子代謝物的動態(tài)變化來反映生物體內(nèi)的生化途徑和潛在的分子機制[11]。多元統(tǒng)計學與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)結(jié)合可以更直觀地看到植物生長過程中代謝物的變化。代謝物種類及水平與農(nóng)作物的營養(yǎng)成分具有相關(guān)性[12]。因此，利用代謝組學揭示肥料對作物代謝的影響是可行的。前人在研究小麥籽粒代謝物時，主要是通過化學方法測定糖類或氨基酸類物質(zhì)的含量，有關(guān)代謝組學方法對代謝物的組成和含量研究較少。有關(guān)減氮施用多種類型肥料對小麥籽粒代謝物影響的報道更少。鑒于上述原因，本試驗擬從代謝組學角度研究不同類型肥料對小麥籽粒代謝物的影響，旨在探究小麥響應肥料的代謝機理，為小麥生產(chǎn)提供施肥新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

供試小麥品種為中信麥99。試驗于2018年10月至2019年6月在天津市武清區(qū)崔黃口鎮(zhèn)進行。試驗田土壤有機質(zhì)17.23 g·kg-1，pH 8.10，全氮 1.03 g·kg-1，速效磷57.35 mg·kg-1，速效鉀157.18 mg·kg-1。

采用隨機區(qū)組設計，設置5種不同氮肥處理，分別為常規(guī)施肥CK和4個減氮施肥處理(緩控釋肥一次性基施E，有機肥和緩控釋肥配施A，緩控釋肥與化肥配施B，專家系統(tǒng)推薦施肥NE)，具體見表1，磷肥、鉀肥均為普通化肥。每個處理設置三個重復，每個重復面積為1 hm2。小麥15 cm等行距種植，播種量為375 kg·hm-2。田間管理與當?shù)卮筇镆恢隆?/p>

1.2 測定方法

1.2.1 樣品處理

將收獲的小麥籽粒經(jīng)液氮研磨至粉末狀，取150.0 mg樣品于1 mL離心管，加入1 mL提取液(異丙醇-乙腈-水體積比1∶1∶1)，4 ℃超聲提取30 min，4 ℃ 10 000 r·min-1離心1 min，取150 μL上清液吹氮后加入10 μL鹽酸甲氧胺吡啶(40 mg·mL-1)，30 ℃水浴90 min；加入30 μL MSTFA+1%TMCS，37 ℃水浴30 min；加入1 mL含有內(nèi)標物的正庚烷溶液(含20 μg·mL-1十一烷)，過0.22 μm濾膜，得到待 測液。

1.2.2 GC-MS條件

試驗儀器為Aglient公司7890 A-5975 C型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜條件：Aglient HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣(純度99.999%)，不分流進樣。升溫程序為常溫升至60 ℃后維持1 min，以10 ℃·min-1升至280 ℃后維持5 min。質(zhì)譜條件：電子碰撞內(nèi)能70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度 150 ℃，溶劑延遲4.5 min，掃描速度2 scan·s-1，范圍50～500 m·z-1，全掃描模式。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2019計算小麥籽粒中代謝物含量，同時對保留時間(rt)及峰面積(intensity)進行預處理；利用SIMCA-P 13.1進行主成分分析(PCA)及偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)，通過SPSS 26.0對代謝物進行方差分析(ANOVA)，篩選差異代謝物。利用Omicshare Tools對差異代謝物進行熱圖聚類分析。通過MetaboAnalyst平臺對差異代謝物進行代謝途徑分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS檢測結(jié)果分析

用GC-MS檢測到小麥籽粒中共有47種代謝物，分別為有機酸12種(26%)、氨基酸10種(21%)、糖類及其衍生物14種(30%)、酯類2種(4%)和其他有機物9種(19%)。

用差異倍數(shù)(FC)表示初始值到最終值的變化程度，對差異倍數(shù)取對數(shù)表示差異的相對變化。以CK為初始值，log2FC是正數(shù)為上調(diào)，是負數(shù)為下調(diào)。由表2可見，與CK相比，其他4種處理總代謝物含量均升高，表現(xiàn)為B>NE>E>A>CK。E、B、NE處理的各類代謝物含量與總代謝物含量趨勢一致；A處理中，有機酸類和氨基酸類含量的變化與總代謝物呈相反趨勢。代謝物對肥料的敏感程度表現(xiàn)為氨基酸類>有機酸類>其他有機物>糖類及其衍生物>酯類。這說明不同施肥處理對小麥籽粒代謝物的影響具有差異性。

表1 各處理施肥情況Table 1 Fertilization of each treatment

2.2 多元統(tǒng)計分析

2.2.1 PCA分析

2.2.2 PLS-DA分析

2.3 差異代謝物篩選

將PLS-DA分析獲得的變量投射重要度(variable importance for the projection，VIP)結(jié)合方差分析(one-way ANOVA)篩選差異代謝物(VIP>1且P<0.05)[14]，最終得出20種差異代謝物(表2)，分別為糖類及其衍生物(6種，30%)、有機酸(5種，25%)、氨基酸(3種，15%)、酯類(2種，10%)、其他有機物(4種，20%)。

2.4 差異代謝物熱圖分析

將20種差異代謝物進行熱圖聚類分析，結(jié)果如圖3，圖3中每一列代表一個樣本，每一個格子代表一種代謝物，顏色深淺代表代謝物的含量高低。由圖3可見，NE和B聚在一支，CK和E聚在一支，A單獨為一支，說明篩選出的差異代謝物能將各處理聚類區(qū)分開來。差異代謝物經(jīng)過聚類也能聚成簇，說明每一簇代謝物可能參與了相同的代謝途徑或者具有相似的功能。

表2 不同施肥條件下的小麥籽粒代謝物及差異倍數(shù)Table 2 Wheat kernel metabolites and the differences under different fertilization conditions

圖1 不同施肥條件下小麥籽粒代謝物PCA得分圖Fig.1 PCA score map of wheat grain metabolites under different fertilization conditions

2.5 代謝通路富集

將篩選出的20種差異代謝物導入MetaboAnalyst平臺，進行通路分析。經(jīng)分析映射出20條代謝途徑(表3)，包括代謝途徑11條，生物合成途徑7條，轉(zhuǎn)化途徑1條，降解途徑1條。其中9條與氨基酸有關(guān)，3條與糖類有關(guān)?？梢姺柿项愋蛯π←溩蚜０被犷惣疤穷惖拇x和生物合成影響較大。

篩選得出3條與差異代謝物具有顯著相關(guān)的代謝途徑(P<0.05或Impact > 0.2)，分別為氨?；?tRNA的生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，異喹啉生物堿的生物合成，均與氨基酸代謝和生物合成有關(guān)。其中最明顯的為氨?；?tRNA的生物合成途徑，有三種差異代謝物富集到此途徑上，分別為色氨酸、絲氨酸和異亮氨酸，從差異代謝物熱圖分析結(jié)果(圖3)上也能看出，這三種氨基酸被聚在一簇。

圖2 不同施肥條件下小麥籽粒代謝物PLS-DA得分圖及200次模型檢驗結(jié)果Fig.2 PLS-DA score map of wheat grain metabolites under different fertilization conditions and 200 model test results

表3 不同施肥條件下的小麥籽粒差異代謝物Table 3 Differential metabolites of wheat grains under different fertilization conditions

3 討 論

3.1 不同施肥處理對小麥籽粒代謝物的影響

氨基酸是評價小麥籽粒營養(yǎng)價值的重要指標之一，氮肥是影響氨基酸合成的重要因素。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CK相比，B與NE處理對小麥籽粒中氨基酸含量的提升效果較優(yōu)。王宜倫等[15]發(fā)現(xiàn)，控釋氮肥可保證部分氮素在夏玉米生育后期釋放，以滿足氮素供應，提高氮肥利用率的同時提高籽粒氮積累量，進而促進了籽粒氨基酸的積累。與CK相比，NE處理優(yōu)化了施氮量及施氮時期。賈良良等[16]研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)分專家系統(tǒng)推薦施肥較農(nóng)民習慣施肥，氮肥的偏生產(chǎn)力平均提高了93.3%，極大的提高了作物氮素吸收效率。

由此可見，高氮素效率是造成B、NE處理高氨基酸積累量的主要原因。A處理抑制了氨基酸的積累，但差異不明顯，這可能與肥料中化肥和有機肥的比例有關(guān)[17]。劉樹堂等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在不同施肥條件下，小麥籽粒中各氨基酸的變異系數(shù)變化較大(5.27%～13.85%)。在本試驗中也出現(xiàn)了類似結(jié)果，與CK相比，四個處理小麥籽粒中氨基酸log2FC為-1.01～ 2.42，說明不同施肥條件對氨基酸的影響較大。

可溶性糖作為淀粉的合成底物和蛋白質(zhì)積累的碳架，具有重要的作用[19]。在本研究中，與CK相比，四個處理均提升了小麥籽粒中糖類的積累量。B處理對糖類含量的促進效果最優(yōu)，log2FC為0.32。肖 強等[20]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)各種控釋肥處理的小麥籽粒中可溶性糖含量均低于普通化肥，這與本試驗結(jié)果不一的原因可能是緩控釋肥在緩釋氮素的同時也緩釋了磷、鉀素，養(yǎng)分釋放高峰期與作物需肥期不一致。而本試驗中僅控釋了氮肥，磷、鉀肥均為普通化肥，養(yǎng)分轉(zhuǎn)化速率高，進而提高了糖類物質(zhì)的含量。A處理效果次之，log2FC為0.22，有機肥和化肥配施能保障養(yǎng)分的供應，有利于碳水化合物的合成，進而促進了糖類物質(zhì)的積累[21]。

圖3 小麥籽粒差異代謝物的熱圖聚類分析Fig.3 Heat map of differential metabolites of wheat grains

表4 代謝通路富集結(jié)果Table 4 Enrichment results of metabolic pathways

3.2 不同施肥處理對小麥籽粒代謝通路的影響

本試驗采用代謝組學方法對小麥籽粒代謝物進行了分析，共得出20條相關(guān)代謝通路。氨酰基-tRNA的生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成和異喹啉生物堿的生物合成3條通路均與氨基酸合成有關(guān)，說明不同施肥條件對小麥籽粒中的氨基酸合成影響較大。其中，氨?；?tRNA的生物合成通路差異最為明顯，色氨酸、絲氨酸和異亮氨酸都被富集到了該通路上。色氨酸和異亮氨酸屬于必須氨基酸，是小麥營養(yǎng)價值的一個重要體現(xiàn)[22]。張玉寧等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在高硝態(tài)氮條件下，煙草根系中參與了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途徑的相關(guān)基因表達量上升。本試驗在同一氮素水平下，不同的氮肥類型也明顯影響了該通路，說明氮肥的使用量和類型均是影響氨基酸生物合成的重要因素。異喹啉生物堿是一類含氮次生代謝物，其合成過程需要苯丙氨酸、色氨酸、賴氨酸和鳥氨酸的衍生物參與，可以累積在特定細胞中起到防御作用，是一種響應不良環(huán)境的自我調(diào)節(jié)機制[24]。

綜上所述，不同施肥條件對小麥籽粒代謝物有明顯影響，B與NE處理有利于氨基酸含量的積累，B與A處理有利于糖類含量的積累。因此，在生產(chǎn)過程中，若以提高氨基酸含量為目的時，可采取緩控釋肥一次性基施或養(yǎng)分專家系統(tǒng)推薦施肥；以提高糖類含量為目的時，可采取緩控釋肥一次性基施或有機肥緩控釋化肥配施。代謝通路中氨基酸相關(guān)通路占比較大，說明通過氨基酸代謝途徑研究不同肥料對小麥籽粒代謝物的影響具有可行性，可為進一步探究代謝機理提供理論基礎(chǔ)。