魏愛麗，楊 茂，黃 琴，張英華，王志敏

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，北京 100193；2.山西太原師范學(xué)院生物系，山西太原 030031)

植物穩(wěn)定碳同位素比率(δ13C)是辨別鑒定植物光合代謝途徑、水分利用效率等生理生態(tài)特性的有效指標(biāo)[10-11]。在植物光合作用過程中，由于光合羧化酶(RuBP羧化酶與PEP羧化酶)及其羧化作用在時(shí)空上的差異對13C有不同的識別和排斥能力，導(dǎo)致C3、C4、CAM植物具有顯著不同的δ13C值，C3植物的δ13C值為-20‰～ -35‰(平均為-26‰)，C4植物為-7‰～-15‰(平均為-12‰),CAM植物為-10‰～-22‰(平均為-16‰)[11-12]。因此，依據(jù)δ13C值可區(qū)分C3、C4、CAM植物，也可分析不同器官的光合特征差異。

普通小麥在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了由2n經(jīng)4n到6n的染色體異源多倍化過程，不同倍數(shù)染色體組小麥種的遺傳背景不同，光合特性表現(xiàn)出較大的差異[13-17]，有關(guān)進(jìn)化過程中葉片RuBP羧化酶活性的變化已有研究[15-17]，但在進(jìn)化過程中不同綠色器官的C4途徑酶活性如何變化？其活性及其變化與光合速率的種間差異有何關(guān)系？這些問題卻很少有報(bào)道。本研究對不同染色體倍數(shù)小麥種的不同器官PEP羧化酶等C4途徑光合酶的活性及δ13C值進(jìn)行了考察，以期明確小麥進(jìn)化過程中C4代謝酶活性的變化趨勢，為發(fā)揮不同器官的光合作用潛力、挖掘和利用高光效種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所選材料為進(jìn)化過程中不同染色體倍數(shù)小麥種及其近緣種(表1)。材料種植于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)園內(nèi)，每材料種4行，重復(fù)3次，越冬期地膜覆蓋，安全越冬。在小麥出苗后，在各重復(fù)小區(qū)選擇12株主莖進(jìn)行標(biāo)記。在各材料開花盛期選生長一致的標(biāo)記主莖，從莖基部剪斷后插入盛水桶中立即帶回實(shí)驗(yàn)室，在室內(nèi)冰臺上分器官進(jìn)行取樣，取樣器官包括旗葉(葉片中部)、旗葉鞘(葉鞘中部)、穗下節(jié)間(伸出葉鞘部分)及穗中部小穗(5個(gè)小穗)的護(hù)穎、成花外穎和芒，各器官鮮樣一部分立即用于酶活性測定，一部分烘干后用于穩(wěn)定碳同位素δ13C測定分析。

1.2 測定方法

1.2.1 酶活性測定

取各器官新鮮樣品(0.5 g)按Camp等[18]的方法進(jìn)行酶液的提取，提取緩沖液為0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH 7.4)，含1 mmol·L-1EDTA，7 mmol·L-1巰基乙醇，10%(w/v)甘油和1%PVP。按1∶6冰浴研磨，15 000 g離心15 min，上清液即為酶提取液。粗提液中可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮蘭法[19]；RuBP羧化酶和PEP羧化酶活性測定按陳根云[20]和查靜娟[21]方法，反應(yīng)體系為1 mL，用紫外分光光度計(jì)追蹤340 nm 處光密度的下降值，并計(jì)算酶活力；蘋果酸酶和蘋果酸脫氫酶的測定按Sayre等[22]的方法稍作改進(jìn)，反應(yīng)體系為1 mL。

1.2.2 穩(wěn)定碳同位素δ13C分析

按Samejima[23]的方法測定。將上述開花盛期所取各器官樣品在80 ℃下烘干至恒重，研磨粉碎并過80目篩。取各器官3～5 mg 粉樣封入燃燒管中，加少量的氧化銅，以鉑(Pr)做催化劑，真空密閉后，800 ℃下反應(yīng)半小時(shí)。釋放出的CO2用MAT-251質(zhì)譜儀測定穩(wěn)定碳同位素δ13C和δ12C，以PDB化石的碳同位素為基準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn))，按公式δ13C=(R樣品/R標(biāo)準(zhǔn)-1)計(jì)算樣品的δ13C值，其中R為樣品或標(biāo)準(zhǔn)的13C/12C比率。

表1 試驗(yàn)材料 Table 1 Experimental materials

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行方差分析，用Duncan新復(fù)極差法檢測差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同綠色器官PEP羧化酶活性的變化

從表2可以看出，小麥不同種的各器官中均含有PEP羧化酶。在不同器官間，二倍體小麥和四倍體小麥的各非葉器官PEP羧化酶活性均高于旗葉，各器官PEP羧化酶活性平均值表現(xiàn)為外穎>護(hù)穎>穗下節(jié)間、葉鞘>芒>旗葉；六倍體小麥穗穎的PEP羧化酶活性也高于旗葉。隨著染色體倍數(shù)從二倍體增加到六倍體，旗葉PEP羧化酶活性呈現(xiàn)明顯增加的趨勢，而各非葉器官PEP羧化酶活性則多表現(xiàn)為顯著降低。

2.2 小麥進(jìn)化過程中不同綠色器官RuBP羧化酶活性的變化

不同小麥種間各器官的RuBP羧化酶活性存在差異(表3)。在不同器官間，各小麥種均表現(xiàn)為旗葉RuBP羧化酶活性高于非葉器官；在不同種間，盡管RuBP羧化酶活性的種間變異性較大，但隨著小麥染色體倍數(shù)的增加，旗葉與非葉器官的平均RuBP羧化酶活性均呈增加的趨勢，六倍體普通小麥品種各器官RuBP羧化酶活性均顯著高于二倍體野生一粒小麥。

2.3 不同綠色器官PEP羧化酶/RuBP羧化酶(PEPC/RuBPC)活性比值的變化

PEPC/RuBPC活性比值可反映C4代謝酶和C3代謝酶的相對活性大小及其變化。由表4可知，從二倍體到四倍體再到六倍體的進(jìn)化過程中，小麥旗葉PEPC/RuBPC平均活性比值趨向增加，而各非葉器官均趨向降低；二倍體小麥種各非葉器官的PEPC/RuBPC平均活性比值顯著高于六倍體小麥，特別是二倍體小麥穗穎的PEPC/RuBPC平均活性比值高于1，顯示其器官中C4代謝活性明顯高于C3代謝活性。

2.4 不同綠色器官C4途徑其他酶活性的變化

從表5～表7可以看出，除六倍體小麥種芒的NAD蘋果酸酶活性稍低于旗葉，其余小麥種所測非葉器官(葉鞘、芒、穗下節(jié)間、護(hù)穎、外穎)的NAD(P)蘋果酸酶(NADP-ME)、NADP-蘋果酸脫氫酶(NADP-MDH)活性均高于旗葉。隨著小麥染色體倍數(shù)的增加，旗葉平均NADP-ME、NADP-MD活性顯著增加，而非葉器官的這些C4酶活性均呈下降趨勢。

表2 小麥進(jìn)化過程中不同器官PEP活性的變化 μmol·mg-1·h-1

表3 小麥進(jìn)化過程中不同器官RuBP羧化酶活性的變化 μmol·mg-1·h-1

表4 小麥進(jìn)化過程中PEPC/RuBPC活性比值的變化Table 4 Change of PEPC/RuBPC ratio in different organs in wheat evolution materials with various ploidy

表5 小麥進(jìn)化過程中NAD蘋果酸酶活性的變化 U·mg-1·min-1

2.5 穩(wěn)定碳同位素(δ13C)值的變化

對野生一粒麥、野生二粒麥和普通小麥品種京411的葉片及穗器官穩(wěn)定碳同位素(δ13C)值進(jìn)行了測定,結(jié)果(圖1)表明，穗器官的δ13C值高于旗葉，前者為-23.8‰～-25.4‰，后者為 -25.5‰～-26‰，六倍體栽培品種與野生一粒麥和野生二粒麥比較，旗葉δ13C值增高，而非葉器官的δ13C值降低。

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，小麥不同種的C3、C4途徑酶活性在不同器官間均存在差異，所有進(jìn)化階段的小麥的C3途徑酶活性均表現(xiàn)為旗葉顯著高于非葉器官，而二倍體和四倍體小麥C4途徑酶活性表現(xiàn)為非葉器官顯著高于旗葉，當(dāng)小麥進(jìn)化至六倍體時(shí)，旗葉的PEPC酶活性顯著提高，僅次于穎片。有關(guān)C3植物不同綠色器官中，PEPC和RuBPC的存在及其活性差異已有報(bào)道，小麥穗器官中PEP羧化酶活性明顯高于旗葉，而RuBPC的活性則以旗葉大于穗器官[8-9，24-25]，這些結(jié)果均與本試驗(yàn)的結(jié)果相類似。值得注意的是，不同進(jìn)化材料比較，非葉器官C4途徑酶(PEPC、NADP-MDH、NADP-ME、NAD-ME)活性以二倍體和四倍體較高，而葉片的C4途徑酶活性卻隨著染色體倍數(shù)的增加而有增加趨勢，這表明在小麥進(jìn)化和染色體倍性增加過程中不同器官的C4途徑代謝活性呈現(xiàn)出不同的變化趨向，二倍體小麥及其近緣種的非葉器官具有較強(qiáng)的C4代謝活性。

表6 小麥進(jìn)化過程中NADP蘋果酸脫氫酶活性的變化 U·mg-1·h-1

表7 小麥進(jìn)化過程中NADP蘋果酸酶活性的變化 U·mg-1·h-1

圖1 小麥不同種不同器官穩(wěn)定碳 同位素(δ13C)值Fig.1 Stable carbon isotope (δ13C) values of different organs in various species of wheat

δ13C的生理學(xué)意義已被確認(rèn)為鑒別植物光合途徑的準(zhǔn)確方法[12]。C3植物的δ13C值平均為-26‰，C4植物為-12‰，CAM植物為-16‰。這種分辨作用直接反映了碳同位素質(zhì)量差異對RuBPC和PEPC的羧化反應(yīng)阻抗與CO2在葉內(nèi)阻抗的不同。利用碳同位素技術(shù)區(qū)分C3、C4和CAM植物已經(jīng)是很成熟的方法，而δ13C的小范圍變化是研究者最為感興趣的。

Zicgler-Jons[25]指出，小麥穗的所有苞葉、燕麥和大麥的內(nèi)外穎可能屬于C3-C4中間型。 Sanchez-Bragado 等[27]研究表明，穗器官的δ13C值在C3植物的范圍內(nèi)。Bont 等[9]通過碳同位素和穩(wěn)定碳同位素等試驗(yàn)證明，C3植物的穗器官中可能不存在C4途徑，但是δ13C的增加說明PEPC可能對初始羧化作用有一定貢獻(xiàn)[9-10]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，旗葉和穗器官的δ13C值均在C3途徑表現(xiàn)的數(shù)值范圍內(nèi)，但器官間有明顯差異，不同倍性材料穗器官的δ13C值均高于葉片，穗器官中以外穎大于護(hù)穎大于芒，可見，穗穎片比葉片更趨近于C4光合途徑。但隨著染色體倍數(shù)的增加，旗葉δ13C值有增高的趨勢，而非葉綠色器官卻呈逐漸下降趨勢。這說明在進(jìn)化過程中旗葉C4型碳同化活性趨向增強(qiáng)，而非葉綠色器官的C4活性趨向減弱，這與同化酶活性測定的結(jié)果趨勢相一致。二倍體小麥非葉器官表現(xiàn)出較高的C4同化酶活性和PEPC/RuBPC的相對活性，其與器官光合作用的關(guān)系有待進(jìn)一步探討。

盡管對小麥非葉器官是否具有C4光合途徑存在爭議[7,9]，但最近仍有報(bào)道顯示小麥籽粒C4光合途徑的證據(jù)[28]。從本試驗(yàn)結(jié)果看，C4途徑代謝酶在不同種的不同器官中均有一定的表達(dá)，特別是非葉器官表現(xiàn)出較強(qiáng)的C4光合酶活性。非葉器官中C4途徑酶的生理作用需要深入研究，其具有較高的C4代謝酶活性也可能與后期適應(yīng)高溫干旱等逆境有關(guān)，在逆境下RuBPC活性易下降，PEPC可能有代謝補(bǔ)償功能[8，25]。隨著染色體倍數(shù)的增加，葉片和非葉器官C4代謝酶活性呈現(xiàn)不同的變化趨向性，其原因尚待探索，其意義尚待明確。由于穗及其他非葉綠色器官是小麥生長后期重要光合器官，其對產(chǎn)量形成具有重要貢獻(xiàn)[8，10，27]。從進(jìn)一步提高小麥光合耐逆性和產(chǎn)量的角度出發(fā)，我們認(rèn)為，改良和充分發(fā)揮C3植物中C4途徑代謝酶的功能作用是有意義的[29-30]，小麥綠色器官特別是非葉器官C4代謝酶活性應(yīng)該進(jìn)一步強(qiáng)化，因此野生種和原始栽培種非葉器官C4途徑高活性資源值得利用。