高 煜，程 斌，丁延慶，曹 寧 ，高 旭，張立異,

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所，貴州貴陽(yáng) 550006)

小麥(TriticumaestivumL.)是世界上最重要的農(nóng)作物之一，全球近35%的人口以小麥為主食[1]。小麥白粉病是由白粉菌(Blumeriagraminisf. sp.Tritici)引起的危害小麥植株地上部分的真菌病害，在世界各麥區(qū)都有發(fā)生[2-4]。西南地區(qū)獨(dú)特的氣候條件，使其成為我國(guó)白粉病發(fā)生普遍且危害較為嚴(yán)重的地區(qū)。農(nóng)藥是減輕白粉病發(fā)生的一項(xiàng)措施，但過(guò)度使用會(huì)造成環(huán)境污染，影響小麥的品質(zhì)，所以培育抗病品種是防治白粉病最為經(jīng)濟(jì)有效且環(huán)境友好的措施[5]。

發(fā)掘新的抗病基因是防治白粉病的常用育種策略。1930年，澳大利亞學(xué)者Waterhouse首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了第一個(gè)抗白粉病基因[6]。此后，Sears等[7]在加拿大小麥品種Axminster的7AL染色體上也定位一個(gè)抗白粉病基因Pm1a。迄今為止，在小麥及其近緣種屬中已有90多個(gè)抗白粉病基因(Pm1～Pm65)被正式命名[8-10]。但是白粉病菌的快速變異，導(dǎo)致大部分抗病基因喪失抗性[11]。目前，抗白粉病基因Pm21在我國(guó)廣泛使用，它來(lái)源于簇毛麥6VS染色體上，具有很好的廣譜抗性和持久性[12]。但是單一抗病基因的過(guò)度利用，也會(huì)對(duì)小麥生產(chǎn)造成威脅。因此，不斷挖掘新的抗病基因?qū)Ψ乐伟追鄄【哂兄匾饬x。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)技術(shù)可以直接鑒定出與表型變異顯著關(guān)聯(lián)的SNP或者基因位點(diǎn)，目前已經(jīng)大量應(yīng)用于小麥重要性狀的功能性等位變異檢測(cè)及基因研究中[13]。隨著基因芯片和測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，基于SNP標(biāo)記的GWAS在抗病基因定位中得到廣泛應(yīng)用[14-15]。通過(guò)GWAS分析，Li等[16]成功定位了位于2B染色體上的三個(gè)白粉病抗性位點(diǎn)，并進(jìn)行了驗(yàn)證；Liu等[17]用185個(gè)美國(guó)冬小麥品種確定了9個(gè)與白粉病抗性顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記。

本研究以主要來(lái)源于我國(guó)西南地區(qū)的120個(gè)小麥品種(系)為材料，利用小麥90K SNP芯片對(duì)白粉病抗性進(jìn)行GWAS分析，確定抗白粉病基因或QTL，并發(fā)掘與已知白粉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，以期為小麥白粉病的遺傳改良和種質(zhì)資源的有效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及白粉病抗性鑒定

120個(gè)普通小麥品種(系)分別來(lái)源于貴州(62個(gè))、四川(36個(gè))和國(guó)內(nèi)其他地區(qū)(河南、湖北、甘肅、江蘇等，共22個(gè))(表1)。于2012―2013年度分別種植于貴州省貴陽(yáng)市、貴州省赫章縣和四川省綿陽(yáng)市，于2013―2014種植于貴州省貴陽(yáng)市，形成四個(gè)不同環(huán)境條件。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，行長(zhǎng)1 m，行距30 cm。以高感白粉病的銘賢169為誘發(fā)材料，每隔五行種植一行，確保發(fā)病充分。常規(guī)大田管理，以環(huán)境中白粉病菌混合生理小種誘發(fā)材料自然發(fā)病。待銘賢169充分發(fā)病時(shí)調(diào)查記錄白粉病反應(yīng)型，采用0～4級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，其中0表示免疫，0；表示近免疫，1表示高抗，2表示中抗，3表示中感，4表示高感[18]。

1.2 DNA提取、90K SNP芯片分型和標(biāo)記掃描

采用改良的CTAB法[19]提取供試材料單株幼嫩葉片DNA。利用小麥90K iSelect SNP芯片(包括81 587個(gè)SNP標(biāo)記)對(duì)120個(gè)小麥品種(系)進(jìn)行SNP分型。芯片檢測(cè)在中玉金標(biāo)記公司完成。利用與抗白粉病基因Pm21緊密連鎖的分子標(biāo)記SCAR1265(R: 5′-CACTCTCCTCAAACCTTGCAAG-3′；L:5′-CACTCTCCTCCACTAACAGAGG-3′)對(duì)這120份小麥材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)在1 265 bp處的擴(kuò)增片段，有DNA條帶的記為1，無(wú)帶記為0。

1.3 數(shù)據(jù)分析

群體結(jié)構(gòu)分析：使用Genome Studio軟件進(jìn)行SNP分型，剔除數(shù)據(jù)缺失頻率>20%、最小等位基因頻率<5%的SNP標(biāo)記，保留高質(zhì)量的SNP標(biāo)記進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用Structure 2.3.4 軟件對(duì)該群體進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析[20]，設(shè)置亞群數(shù)目K為1～12，5次模擬運(yùn)算，模擬參數(shù)迭代(length of bum-in period)和蒙特卡羅迭代(markov chain monte carlo,MCMC)設(shè)置為 10 000次循環(huán)，在混合模型和頻率相關(guān)模型下運(yùn)算。輸出后驗(yàn)概率值的結(jié)果輸入Structure Harvester(http://taylor0.biology.ucla.edu/struct-ure Harvester/)，計(jì)算2個(gè)連續(xù)的后驗(yàn)概率值的變化速率(ΔK)和每個(gè)材料在1～12亞群的Q值，以Q=0.5為分界線(xiàn)，最終確定群體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)。

主成分分析(principal component analysis，PCA)：運(yùn)用R語(yǔ)言包GAPIT對(duì)自然群體進(jìn)行PCA群體結(jié)構(gòu)分析和親緣關(guān)系評(píng)估，計(jì)算親緣關(guān)系K矩陣。親緣關(guān)系代表兩個(gè)特定材料之間的遺傳相似度與任意材料之間遺傳相似度的相對(duì)值，當(dāng)供試材料之間的親緣關(guān)系值為負(fù)值時(shí)，將其定義為0[21]。

表1 120個(gè)小麥品種(系)的名稱(chēng)、來(lái)源及其在主成分分析(PCA)中的類(lèi)群Table 1 Names, origins and PCA(principal component analysis) groups of 120 wheat varieties(lines)

全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)：利用質(zhì)控后得到的37 790個(gè)高質(zhì)量的SNP標(biāo)記，運(yùn)用R語(yǔ)言包GAPIT中的FarmCPU模型(http://zzlab.net/FarmCPU/index.html)[22]對(duì)4個(gè)環(huán)境下小麥品種的抗白粉病表型分別進(jìn)行GWAS，閾值為 -log10(2.6×10-7)(以顯著性水平為0.01，質(zhì)控后得到的37 790個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記來(lái)計(jì)算閾值)，判定SNP標(biāo)記與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的顯著性。

相關(guān)性分析：利用SPSS v20軟件，計(jì)算Pm21連鎖標(biāo)記SCAR1265與6A染色體上顯著關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記的Pearson相關(guān)系數(shù)。

表2 4個(gè)環(huán)境下120個(gè)小麥品種(系)中抗病 和感病品種(系)的比例Table 2 Ratio of resistant and susceptible varieties(lines) to 120 wheat varieties(lines) in four environments %

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥品種(系)成株期抗白粉病鑒定結(jié)果

從表2可以看出，不同環(huán)境下抗病材料所占比例不同，其中，2014年貴陽(yáng)環(huán)境條件下，白粉病表現(xiàn)抗性的品種(系)占比最高(70.8%)，2013年綿陽(yáng)環(huán)境條件下占比最低(36.7%)。36個(gè)品種(系)(30%)在四種環(huán)境下均表現(xiàn)為抗病，其中，貴州省品種(系)30個(gè)，四川省品種(系)4個(gè)，其他地區(qū)品種(系)2個(gè)(表3)。另外有18個(gè)品種(系)在四個(gè)環(huán)境下都表現(xiàn)為感病，包括貴州省品種(系)4個(gè)，四川省品種(系)9個(gè)，其他地區(qū)品種(系)5個(gè)。在不同環(huán)境下，抗病品種(系)中來(lái)自貴州省的都最多，占比均超過(guò)50%，其次是四川省，其他地區(qū)抗病品種(系)比例較低(表4)。由此可見(jiàn)，本試驗(yàn)中貴州省小麥品種(系)的抗病性表現(xiàn)較好。

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析

從圖1可以看出，當(dāng)K=6時(shí)，ΔK取得最大值，因此，試驗(yàn)群體可分為6個(gè)類(lèi)群。其中，第一類(lèi)群[20個(gè)品種(系)]、第二類(lèi)群[27個(gè)品種(系)]和第四類(lèi)群[20個(gè)品種(系)]的小麥材料主要來(lái)自貴州省和四川省，第三類(lèi)群[13個(gè)品種(系)]和第五類(lèi)群[20個(gè)品種(系)]的小麥材料主要來(lái)自貴州省，第六類(lèi)群[20個(gè)品種(系)]的小麥材料來(lái)自其他地區(qū)。

為了進(jìn)一步了解這些小麥材料的親緣關(guān)系，對(duì)供試材料進(jìn)行主成分分析。結(jié)果(圖2)表明，120個(gè)小麥品種(系)按地理來(lái)源聚集形成兩個(gè)類(lèi)群。PC1解釋了全部遺傳變異的12.8%，PC2解釋了全部遺傳變異的8.4%。位于圖2左上側(cè)的類(lèi)群主要由來(lái)自四川省和其他地區(qū)的小麥品種(系)組成，在PC2水平上分布較為集中。來(lái)源于貴州省的小麥品種(系)以及銘賢169聚集在右下側(cè)，在PC1水平上分布較分散，其中由貴州大學(xué)選育的小麥品種(系)(包括貴農(nóng)系列、TP2、硬葡1等)分布更分散。

2.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)

利用37 790個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)120個(gè)小麥品種(系)在四個(gè)環(huán)境中的白粉病抗性分別進(jìn)行GWAS，共檢測(cè)到16個(gè)與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記(圖3、表5)，分布于1A(2)、1D(2)、2A(2)、3A(2)、4B(1)、5B(1)、6A(3)、6D(2)和7B(1)染色體上。

在2013年貴陽(yáng)環(huán)境條件下，檢測(cè)到6個(gè)與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，分別位于1A、1D、3A、4B、5B和6A染色體上。在2013年赫章環(huán)境條件下，只檢測(cè)到1個(gè)與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)的SNP，位于6A染色體上。在2013年貴陽(yáng)環(huán)境條件下，檢測(cè)到6個(gè)與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，分別位于1D、3A、4B、6A和6D染色體上。在2014年貴陽(yáng)環(huán)境條件下，共檢測(cè)到6個(gè)與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，分別位于1A、2A、6A、6D和7B染色體上。

有多個(gè)染色體區(qū)段在2～4個(gè)環(huán)境中均被檢測(cè)到。其中，位于6AS染色體大約44 cM處的區(qū)段，在4個(gè)環(huán)境中均被檢測(cè)出與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)，包含3個(gè)SNP位點(diǎn)，其中，Jagger_c4823_169在2013年貴陽(yáng)和2013年綿陽(yáng)兩個(gè)環(huán)境中均被檢測(cè)到，位于6A染色體43.85 cM處，P值分別為 7.24E-53和5.76E-27；Tdurum_contig55201_928在2013年赫章環(huán)境中被檢測(cè)到，位于6A染色體44.06 cM處，P值為2.39E-08；Tdurum_contig12215_89在2014年貴陽(yáng)環(huán)境中被檢測(cè)到，位于6A染色體44.11 cM處，P值為4.17E-30，這3個(gè)SNP標(biāo)記均顯示與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)。位于3A染色體43.44 cM處的SNP(Excalibur_c3510_1888)和位于4B染色體49.44 cM處的SNP(BS00011148_51)在2013年貴陽(yáng)和2013年綿陽(yáng)兩個(gè)環(huán)境中均被檢測(cè)到，且與白粉病抗性顯著 關(guān)聯(lián)。

表3 四種環(huán)境下均表現(xiàn)抗病的品種(系)Table 3 Resistant varieties(lines) in four environments

表4 4種環(huán)境中不同地區(qū)抗病品種(系)的頻率Table 4 Percentage of resistant varieties(lines) from different regions in four environments %

A：△K折線(xiàn)圖；B：群體結(jié)構(gòu)分析。

圖2 120個(gè)小麥品種(系)的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of 120 wheat varieties(lines)

2.4 相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證6A染色體上的重要位點(diǎn)與抗白粉病基因Pm21的關(guān)系，利用與Pm21緊密連鎖的分子標(biāo)記SCAR1265對(duì)這120個(gè)小麥品種(系)小麥材料進(jìn)行掃描，部分小麥品種的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示。分型結(jié)果顯示，這3個(gè)SNP標(biāo)記(Jagger_c4823_169，Tdurum_contig55201_928，Tdurum_contig12215_89)與SCAR1265的Pearson相關(guān)系數(shù)R值分別為0.85、0.77和0.87(P<0.01)，說(shuō)明這3個(gè)SNP標(biāo)記與Pm21分子標(biāo)記位點(diǎn)緊密連鎖。

3 討 論

3.1 西南地區(qū)小麥白粉病抗性

小麥白粉病常發(fā)生在潮濕的地區(qū)，而西南地區(qū)因其特有的氣候地理特征，使得白粉病菌能夠安全越夏，并加快生理小種的變異，這是西南地區(qū)小麥白粉病及其他病害高發(fā)的重要原因。

本研究抗性鑒定結(jié)果顯示，2014年貴陽(yáng)環(huán)境條件下抗白粉病的小麥品種(系)占比最高，原因可能是由于當(dāng)年氣候較為干燥，導(dǎo)致白粉病發(fā)病不充分。在120個(gè)小麥品種(系)中，有36個(gè)在四個(gè)環(huán)境下都表現(xiàn)為抗病，其中，來(lái)自貴州省的小麥品種(系)中抗病品種比例最高，原因可能是貴州麥區(qū)白粉病菌的毒力強(qiáng)，而在植物-病菌協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，育種家通過(guò)人工選擇，使該地區(qū)小麥品種具有較好的抗病性[23]。這對(duì)貴州地區(qū)小麥抗白粉病品種抗性基因資源的利用和推廣有重要的 意義。

綠色線(xiàn)為SNP顯著性的閾值,等于-log10(2.6×10-7)。

3.2 西南地區(qū)小麥白粉病的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)

本研究全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，16個(gè)SNP標(biāo)記與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)，分布在1A、1D、2A、3A、4B、5B、6A、6D和7B染色體上，其中，3A、4B和6A染色體上分別有1個(gè)重要的染色體區(qū)段在2或4個(gè)環(huán)境中均能被檢測(cè)到。

本研究在2013年貴陽(yáng)和2013年綿陽(yáng)兩個(gè)環(huán)境條件下，分別在3A(約43.44 cM)和4B(約 49.44 cM)染色體的兩個(gè)區(qū)段檢測(cè)到與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)。目前，3A染色體上已鑒定出的抗白粉病基因?yàn)镻m44，而4B染色體上暫無(wú)報(bào)道[24-25]。Lillemo等[26]利用Saar和Avocet構(gòu)建的113個(gè)重組自交系群體，在3AS和4BL染色體上分別檢測(cè)到一個(gè)抗白粉病QTL，均與本研究檢測(cè)到的位點(diǎn)不同。Keller等[27]利用Forno和Oberkulmer構(gòu)建的226個(gè)重組自交系，分別在3A(40～62 cM)和4B(84～88 cM)染色體上檢測(cè)到一個(gè)抗白粉病QTL，推測(cè)本研究在3A染色體上檢測(cè)到的位點(diǎn)位置與前人研究結(jié)果相似，而在4B染色體上檢測(cè)到的位點(diǎn)位置不同。Liang等[28]利用Fukuho-komugi和Oligoculm構(gòu)建的107個(gè)DH群體，在4BL(41.38～44.59 cM)染色體上檢測(cè)到一個(gè)抗白粉病QTL，推測(cè)與本研究在4B染色體上的SNP位點(diǎn)位置相似。本研究供試小麥品種(系)中能夠同時(shí)檢測(cè)到這兩個(gè)位點(diǎn)的品種(系)有硬葡1、硬葡2和一粒葡8-1等材料，均來(lái)自貴州省。目前，這些材料對(duì)小麥白粉病仍然表現(xiàn)出較好的抗病性，在育種中具有一定的利用價(jià)值。

本研究在四個(gè)環(huán)境條件下，在6AS染色體43.85～44.11 cM區(qū)段檢測(cè)到3個(gè)與白粉病抗性顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記，分別為Jagger_c4823_169、Tdurum_contig55201_928和Tdurum_contig12215_89。6AS染色體上已鑒定出的抗白粉病基因?yàn)镻m21，與Pm21緊密連鎖的分子標(biāo)記為SCAR1265[29]。本研究檢測(cè)到的3個(gè)SNP標(biāo)記也與Pm21緊密連鎖。在120個(gè)小麥品種(系)中，能夠同時(shí)檢測(cè)到這4個(gè)SNP標(biāo)記的有33個(gè)，其中來(lái)自貴州省的有26個(gè)，包括安麥7號(hào)、308、黔麥12、黔麥18、黔麥19、夏繁28、黔9939-5、貴農(nóng)18、貴農(nóng)22、貴農(nóng)25、貴農(nóng)26、貴農(nóng)28、貴農(nóng)775、節(jié)燕普3號(hào)、TG、TP2、TP3、P5-1、以光-3、以特選1、以特選2、固優(yōu)1、貴協(xié)4、P13-1、P13-3和P13-5；來(lái)自四川省的有5個(gè)，包括綿麥185、綿麥228、綿麥367、綿麥37和綿麥39；來(lái)自其他地區(qū)的有2個(gè)，包括92R137和南農(nóng)24。Jagger_c4823_169、Tdurum_contig55201_928、Tdurum_contig12215_89這3個(gè)SNP位點(diǎn)和分子標(biāo)記SCAR1265在西南地區(qū)小麥品種(系)中出現(xiàn)的頻率較高，分別為37.8%、34.7%、35.7%和 41.8%，說(shuō)明西南地區(qū)小麥品種(系)中含有Pm21基因的品種(系)較多。江 崢等[30]利用開(kāi)發(fā)的Pm21特異性標(biāo)記對(duì)662個(gè)小麥品種(系)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)西南地區(qū)小麥材料中Pm21的使用頻率最高 (34.4%)；鄒景偉[31]利用Pm21的連鎖標(biāo)記對(duì)參試品種進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有15個(gè)品種可能含有Pm21基因，其中，有11個(gè)來(lái)自西南冬麥區(qū)，與本研究結(jié)果一致。說(shuō)明Pm21基因在西南地區(qū)小麥品種(系)中分布頻率較高，有加大病原菌定向選擇壓力的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)西南地區(qū)小麥生產(chǎn)造成威脅。因此，在今后的小麥抗病育種工作中，要加強(qiáng)白粉病新抗源的發(fā)掘，同時(shí)通過(guò)多個(gè)抗病基因的聚合，選育抗病性更為持久的小麥品種。

表5 小麥白粉病抗性顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記Table 5 Significant SNP markers associated with wheat powdery mildew resistance

M: DL2000；1：黔麥17；2：黔麥18；3：黔麥19；4：夏繁28；5：黔9939-5；6：豐優(yōu)1號(hào)；7：豐優(yōu)2號(hào)；8：豐優(yōu)3號(hào)；9：豐優(yōu)6號(hào)；10：豐優(yōu)7號(hào)；11：豐優(yōu)8號(hào)；12：豐優(yōu)9號(hào)；13：豐優(yōu)10號(hào)；14：豐優(yōu)92212；15：興育7號(hào)；16：興育823；17：CN04-1；18：淮麥18；19：92R137；20：南農(nóng)04y10；21：南農(nóng)24；22：南農(nóng)06y603；23：小偃54；24：綿麥1403；25：綿麥185；26：綿麥228；27：綿麥367；28：綿麥37；29：綿麥39。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)對(duì)主要來(lái)源于西南地區(qū)的120個(gè)小麥品種(系)的白粉病抗性進(jìn)行GWAS，獲得16個(gè)與白粉病抗性顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)。在6A染色體上有3個(gè)SNP標(biāo)記，遺傳距離小于1 cM，與Pm21基因緊密連鎖。本研究結(jié)果說(shuō)明，Pm21在西南地區(qū)小麥白粉病抗性育種中發(fā)揮了巨大作用。但在今后的小麥抗病育種中應(yīng)該使用更多不同的抗病基因，以降低Pm21過(guò)度使用給西南地區(qū)的小麥生產(chǎn)帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。