段賽菲, 黃艷娜, 王金斌, 束仕元, 周茂超, 唐雪明*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院, 上海 201306; 2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 上海 201106)

中國(guó)作為世界上最大的氮肥生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中的氮肥盈余成為環(huán)境污染因子[1]，目前我國(guó)氮肥使用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過作物最高產(chǎn)量需求量，過多的氮肥消耗成為環(huán)境污染的主要因素。生物固氮是工業(yè)氮肥最有效的替代品之一，可減少氮肥的使用，提高氮肥利用率，建設(shè)環(huán)境友好型農(nóng)業(yè)[1]，同時(shí)能夠減少溫室氣體、酸雨及地表水和地下水的硝酸鹽污染[2]。

細(xì)菌的固氮酶能夠?qū)⒖諝庵械姆肿拥?N2)還原成氨(NH3)[3]，固氮菌通過固氮酶生物固氮可以提高全球生產(chǎn)力[4]。褐球固氮菌(Azotobacterchroococcum)是一種自生固氮菌，由于其不需要與一定的植物配合，因而具有適應(yīng)性廣的特點(diǎn)，在氮素循環(huán)中具有重要作用，是重要的農(nóng)業(yè)菌劑。已有研究證實(shí)，褐球固氮菌對(duì)春小麥[5]、枸杞[6]、棉花[7]等作物的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用，還可提高氮肥利用率[6]以及減少氮肥用量，接種褐球固氮菌可以減少50%棉花生長(zhǎng)所需氮肥的施用量[7]。因此，褐球固氮菌在農(nóng)業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。

常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)誘變育種技術(shù)目前在生物育種領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，通過育種儀產(chǎn)生均勻的等離子體射流對(duì)菌株進(jìn)行誘變，隨著處理時(shí)間的增加會(huì)導(dǎo)致誘變菌株的堿基與核糖之間、堿基上的氨基以及磷酸二酯中的P-O鍵發(fā)生斷裂，將寡核苷酸鏈斷裂成小片段，最終形成多個(gè)突變位點(diǎn)而改變菌株的基因序列[8-9]。相對(duì)于傳統(tǒng)誘變方法，射流中具有化學(xué)活性的粒子能夠引發(fā)種類非常豐富的DNA損傷，最終得到大容量突變庫(kù)，大容量突變庫(kù)容易快速獲得性能優(yōu)良且遺傳穩(wěn)定的誘變菌株，且ARTP誘變育種技術(shù)操作簡(jiǎn)便、安全無毒[10]。目前，ARTP已經(jīng)成功應(yīng)用于包括細(xì)菌、真菌和微藻在內(nèi)的40多種微生物的誘變育種[10]；大腸桿菌AFP111是一種為增加琥珀酸積累而產(chǎn)生的自發(fā)突變體，在ARTP誘變后，獲得了具有1.33倍高的ATP產(chǎn)生和明顯的琥珀酸產(chǎn)生的突變體[11]；ε-Poly-L-lysine(ε-PL)是一種具有廣泛抗菌活性的新型食品生物保護(hù)劑，使用ARTP處理鏈霉菌(Streptomycesalbulus)孢子后，得到的突變株S.albulusA-29的產(chǎn)ε-PL能力是野生菌株的4倍[12]；何建華等[13]首次利用ARTP誘變草菇原生質(zhì)體，得到了3株抗低溫脅迫能力比誘變前提高24 h的突變株。但目前對(duì)固氮菌株的誘變，還鮮有報(bào)道。為提高現(xiàn)有褐球固氮菌的固氮能力，本研究首先通過ARTP誘變出發(fā)菌株褐球固氮菌，用乙炔還原法篩選出一株高酶活突變株28s-20，經(jīng)5次傳代培養(yǎng)確定該菌株的遺傳穩(wěn)定性，并用盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證其固氮效能，為提高褐球固氮菌固氮酶活性及固氮效能提供了簡(jiǎn)便有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1材料褐球固氮菌CICC21686購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；‘申科糯1號(hào)’玉米種子由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行基地提供。

1.1.2試劑蔗糖、瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、氫氧化鈉、甘露醇、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaSO4·2H2O購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Na2MoO4·2H2O、FeCl3、考馬斯亮藍(lán)G-250、結(jié)晶紫購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基固氮菌種子培養(yǎng)基：酵母提取物0.5 g，甘露醇20.0 g，KH2PO40.2 g，K2HPO40.8 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，F(xiàn)eCl3微量，Na2MoO4·2H2O微量，瓊脂15.0 g，蒸餾水定容至1.0 L，pH 7.2；固體培養(yǎng)基每升加15.0～20.0 g瓊脂。

無氮培養(yǎng)基：蔗糖5.0 g，KH2PO42.0 g，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eCl30.005 g，CaCO30.1 g，蒸餾水定容至1.0 L，pH 7.0～7.5；固體培養(yǎng)基每升加15.0～20.0 g瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

常壓室溫等離子體誘變儀-ⅡS(無錫源清天木生物科技有限公司)、安捷倫7890B氣相色譜儀(安捷倫科技有限公司)、Evolution 60紫外-可見分光光度計(jì)(Thermo Fisher)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1ARTP誘變菌懸液制備：取1 mL褐球固氮菌種子液至裝有100 mL固氮菌液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)48 h，取1 mL菌液于無菌EP管中，4 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，棄去上清液，余下的菌體用1 mL無菌生理鹽水懸浮，稀釋至OD600為0.6～0.8。

等離子誘變處理：ARTP功率設(shè)定120 W，通氦氣載氣流速為10 L·min-1，冷卻水循環(huán)機(jī)溫度為20 ℃，將上述菌體懸浮液與10%甘油按1∶1比例混合，取10 μL均勻涂布于與誘變儀配套使用的無菌不銹鋼載片上，處理時(shí)間從0 s開始，每4 s一個(gè)遞增，至52 s。每個(gè)樣品處理結(jié)束后，不銹鋼載片會(huì)自動(dòng)掉落至裝有1 mL無菌生理鹽水的2 mL無菌EP管內(nèi)，待樣品全部處理完畢后取下EP管，在振蕩器上將菌體振蕩洗脫。

致死率計(jì)算：統(tǒng)計(jì)不同處理時(shí)間下無氮培養(yǎng)基平板上的菌落數(shù)，計(jì)算致死率。

式中，A指ARTP處理后平板上生長(zhǎng)出的菌落數(shù)，B指樣品誘變處理0 s的總菌落數(shù)。

1.3.2固氮酶活性測(cè)定采用乙炔還原法[13]測(cè)定固氮酶活性，固氮菌在斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后更換橡膠塞，向體系注入乙炔氣體，使其終濃度為10%，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取1 mL反應(yīng)氣體用氣相色譜儀測(cè)定，根據(jù)乙烯(C2H4)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算乙烯生成量。菌株固氮酶活性用每毫克菌體每h將乙炔還原為乙烯的量表示，按照以下公式計(jì)算。

固氮酶活性=

式中，P為氣壓(mmHg)，t為反應(yīng)溫度(℃)[14]。參考孫建光等[15]的方法用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定菌體蛋白量，根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌體蛋白含量。

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取7只試管，分別加入濃度為0.5 mg·mL-1的牛血清白蛋白溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，再依次分別加入1.0、0.9、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL蒸餾水，每支試管加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液；振蕩搖勻各試管內(nèi)液體，靜置5 min，測(cè)定595 nm處吸光值A(chǔ)595，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，A595為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3高固氮酶活菌株篩選①平板初篩。取200 μL經(jīng)過ARTP誘變、振蕩洗脫的菌液，均勻涂布在無氮固體培養(yǎng)基，每個(gè)時(shí)間梯度3次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)48 h，從各試驗(yàn)組中的無氮培養(yǎng)基平板上共挑選出36個(gè)生長(zhǎng)狀態(tài)良好、菌落較大的單菌落，對(duì)照組的菌株編號(hào)為1號(hào)，各試驗(yàn)組的菌株按照挑選順序分別編號(hào)為2～37號(hào)，接種無氮培養(yǎng)基液體試管，28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)48 h。參照1.3.2測(cè)定36個(gè)菌株的固氮酶活性，以篩選發(fā)生正突變且固氮酶活性大幅提升的菌株。

②復(fù)篩。將篩選出的正向突變菌株轉(zhuǎn)接至無氮液體培養(yǎng)基28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)48 h后轉(zhuǎn)接至固氮斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h，參照1.3.2測(cè)定篩選菌株的固氮酶活性，驗(yàn)證菌株的酶活穩(wěn)定性。

1.3.4誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性分析為驗(yàn)證突變株的遺傳穩(wěn)定性，將復(fù)篩后獲得的最優(yōu)突變株28s-20傳代培養(yǎng)5代，無氮固體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接至無氮固體培養(yǎng)基為一代，每代均接種裝有3 mL無氮培養(yǎng)基液體試管，28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)72 h，參照1.3.2檢測(cè)每一代菌種的固氮酶活性。

1.3.5最優(yōu)突變株的生物學(xué)特性檢測(cè)將野生菌和最優(yōu)突變株的種子液接種到裝有100 mL固氮菌液體培養(yǎng)基。

1.3.6誘變固氮菌對(duì)植物生長(zhǎng)量的影響采用盆栽試驗(yàn)，設(shè)置接種無氮培養(yǎng)基(對(duì)照)、接種褐球固氮菌CICC21686和突變株28s-20共3個(gè)處理，檢驗(yàn)誘變固氮菌對(duì)玉米生長(zhǎng)的影響。三角瓶中的培養(yǎng)基設(shè)置不同溫度梯度，分別為26、28、30、32和34 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)48 h后測(cè)定OD600，每個(gè)溫度梯度3次重復(fù)；設(shè)置不同初始pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)48 h后測(cè)定OD600，每個(gè)pH梯度3次重復(fù)。盆栽土壤取自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)試驗(yàn)地，試驗(yàn)前，將土壤用2 mm過篩，121 ℃滅菌1 h，待冷卻后重新滅菌，3次重復(fù)。盆栽容器為8 cm×16 cm×8 cm(高×盆口直徑×盆底直徑)，每盆裝等量干燥土。處理方法：將玉米種子用95%酒精處理5 min，傾去酒精，加入3%NaClO溶液處理2 min，傾去NaClO溶液，無菌水沖洗5次；播種玉米種子5粒，播種深度為1～2 cm，玉米兩葉一心期定苗，每盆保留長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗4株；每個(gè)處理3盆，設(shè)置3組平行試驗(yàn)，共27盆。試驗(yàn)在上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院組織培養(yǎng)室進(jìn)行，室內(nèi)溫度28 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗。

將褐球固氮菌CICC21686和突變株28s-20在無氮培養(yǎng)基(CK)培養(yǎng)48 h，稀釋至OD600為1.5，試驗(yàn)組菌劑接種量100 mL·盆-1，對(duì)照組施等量的無氮培養(yǎng)基，2 d接種一次，共接種7次。待幼苗生長(zhǎng)14 d后，收獲，將植株烘干至恒重，分析植株干重及全氮量，植株全氮量由南京維百瑞生物科技有限公司測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft office 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 8.5繪圖，SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘變時(shí)間的致死率

褐球固氮菌的致死率曲線如圖1所示，隨著誘變處理時(shí)間的增加，菌體的致死率不斷上升。誘變時(shí)間為12 s時(shí)，致死率達(dá)到80%以上；處理時(shí)間為20 s時(shí)，致死率相對(duì)于16 s略有下降，為77.7%，其致死率的下降可能是由于細(xì)胞啟動(dòng)損傷修復(fù)機(jī)制[16]；誘變時(shí)間為24 s時(shí)，致死率又重新上升，可能是由于細(xì)胞受到的損傷超出了自身的修復(fù)能力，導(dǎo)致?lián)p傷無法繼續(xù)修復(fù)，從而使得致死率再次升高[17]，誘變時(shí)間為36 s及以上時(shí)，致死率達(dá)到100%。

圖1 不同誘變時(shí)間的褐球固氮菌菌株致死率曲線

2.2 突變株的篩選

2.2.1初篩菌株的固氮酶活性初篩挑選出36株突變菌株，由這些菌株的酶活性及相對(duì)于野生菌的增長(zhǎng)率結(jié)果(圖2)可知，突變具有隨機(jī)性，且發(fā)生正負(fù)向突變與誘變時(shí)間的長(zhǎng)短無關(guān)，各誘變組均存在正負(fù)向突變。但當(dāng)誘變時(shí)間為28 s時(shí)，致死率即達(dá)到94.6%，正突變率較高，且酶活力增長(zhǎng)率與其他誘變時(shí)間組相比增長(zhǎng)幅度較大。表明隨著誘變致死率的升高，產(chǎn)生高酶活突變株的可能性越大。挑選的36株菌株中，有21株誘變株的固氮酶活高于野生菌，即58.33%的菌株發(fā)生了正向突變，其余為負(fù)向突變株，其酶活力有不同程度的降低。

圖2 誘變褐球固氮菌菌株的固氮酶活性及酶活增長(zhǎng)率

2.2.2復(fù)篩菌株的固氮酶活性在21株正向突變株中，有10株突變株的酶活比野生菌高60%以上，為檢驗(yàn)其遺傳穩(wěn)定性，選擇這10株菌株重新測(cè)定酶活進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩結(jié)果見圖3，可知，編號(hào)28s-20突變株的固氮酶活性與初篩時(shí)相當(dāng)，為(207.47±6.73) nmol·mg-1·h-1，高于野生菌101.72%。編號(hào)28s-18的菌株酶活增長(zhǎng)率在58.94%，相較于初篩時(shí)的酶活降低了22.04%，其余菌株的固氮酶活性均有不同程度的下降，均遠(yuǎn)低于初篩結(jié)果，表明這些菌株不具備遺傳穩(wěn)定性。因此，選擇28s-20作為最優(yōu)突變株并繼續(xù)檢驗(yàn)其遺傳穩(wěn)定性。

圖3 初篩誘變菌株的固氮酶活性及增長(zhǎng)率

2.2.3菌株28s-20的遺傳穩(wěn)定性分析 為了驗(yàn)證篩選得到的最優(yōu)突變菌株的遺傳穩(wěn)定性，對(duì)28s-20進(jìn)行傳代培養(yǎng)，同條件下測(cè)定發(fā)酵后的固氮酶活性，結(jié)果(圖4)顯示，隨著傳代次數(shù)的增加，固氮酶活性始終穩(wěn)定在210 nmol·mg-1·h-1左右，表明突變株28s-20具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖4 連續(xù)培養(yǎng)5代的褐球固氮菌突變株的固氮酶活性

2.3 菌株28s-20的生物學(xué)特性

2.3.1最適生長(zhǎng)溫度不同溫度的菌株生長(zhǎng)結(jié)果見圖5，可見，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，野生株CICC21686和突變株28s-20的生長(zhǎng)能力均最好，表明兩株菌的最佳培養(yǎng)溫度均為28 ℃，說明誘變對(duì)其最適生長(zhǎng)溫度未產(chǎn)生影響。

注：不同小寫字母表示同一菌株不同溫度間差異在P<0.05水平具有顯著性。

2.3.2最適初始pH不同初始pH的野生株CICC21686和突變株28s-20菌株的生長(zhǎng)結(jié)果見圖6，可見，培養(yǎng)基初始pH在7.5左右時(shí)，28s-20的OD600最高，其生長(zhǎng)能力最好，而pH升高或降低都會(huì)導(dǎo)致其生長(zhǎng)能力下降。野生株CICC21686在pH 7.0～8.5培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)勢(shì)相近，說明其最適pH范圍較寬，表明誘變可能提高了褐球固氮菌菌株對(duì)pH的敏感程度。

注：不同小寫字母表示同一菌株不同pH間差異在P<0.05水平具有顯著性。

2.4 菌株28s-20對(duì)植物生長(zhǎng)及其固氮效能的影響

不同菌株處理的玉米植株固氮指標(biāo)結(jié)果(表1)顯示，接種野生株CICC21686和突變株28s-20的處理組與施用無氮培養(yǎng)基的對(duì)照組相比，植株干重及氮含量均顯著增加(P<0.05)。而且突變株28s-20的玉米植株干重和氮含量較野生株CICC21686也均顯著增加(P<0.05)，植株干重及含氮量分別增加了21.16%和34.36%。表明褐球固氮菌CICC21686和突變株28s-20均能夠增加玉米的固氮效能，突變株28s-20較野生株CICC21686的效果更好。

表1 褐球固氮菌處理的玉米生長(zhǎng)及固氮指標(biāo)

3 討論

固氮菌通過其固氮酶進(jìn)行生物固氮， Niu等[18]在小麥、小白菜和荷花等植物根際共分離得到30株固氮菌，其中，菌株的固氮酶活性最高的為(38.65±30.40) nmol·mg-1·h-1。孫建光等[19]在小麥、水稻等作物中分離得到92株內(nèi)生固氮菌，在純培養(yǎng)條件下，其固氮酶活性為0.30～254.12 nmol·mg-1·h-1，本研究獲得的褐球固氮菌菌株的固氮酶活為(207.47±6.73) nmol·mg-1·h-1，高于Niu等[18]和孫建光等[19]研究的90株固氮菌。

已有許多研究證實(shí)，ARTP誘變方法具有良好篩選效果，Zhang等[20]采用ARTP誘變技術(shù)獲得了木糖醇高產(chǎn)菌株，使其收獲率提高了22%，并通過進(jìn)一步生化分析表明，突變體中的相對(duì)基因表達(dá)和木糖還原酶的酶活性高于原始菌株，部分解釋了木糖醇的高產(chǎn)率。本研究利用ARTP對(duì)褐球固氮菌進(jìn)行誘變，獲得的褐球固氮菌菌株28s-20的固氮酶活性較出發(fā)菌株提高了101.72%，證實(shí)ARTP誘變對(duì)褐球固氮菌具有良好的選育效果。然而，孫建光等[15]研究認(rèn)為，高固氮酶活性并不總意味著高固氮效能。因此，本研究通過玉米盆栽試驗(yàn)對(duì)菌株的固氮效能進(jìn)行了深入研究確認(rèn)，證實(shí)褐球固氮菌的高酶活誘變株相對(duì)于野生菌能夠顯著提高玉米植株的干重和全氮量，其固氮效能可達(dá)到(38.43±0.91) mg·g-1，而蔡苗等[21]在油茶林中篩選得到的高固氮菌固氮效能最高為31.35 mg·g-1，低于本研究的固氮效能。本研究通過誘變篩選獲得高固氮酶活性且遺傳穩(wěn)定的誘變株，并證實(shí)ARTP誘變能夠顯著提升其固氮效能，為提高褐球固氮菌固氮酶活性提供了有效方法。Gao等[22]通過ARTP技術(shù)誘變米曲霉(Aspergillusoryzae)3.042增強(qiáng)了其耐鹽蛋白酶的活性，其中，耐鹽堿性蛋白酶基因和天冬氨酰氨肽酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的增加，解釋了突變菌株H8中蛋白酶活性的增加應(yīng)部分歸因于蛋白酶表達(dá)的增加。固氮酶復(fù)合物是生物中最復(fù)雜的金屬酶之一[23]，其通過鐵蛋白與鉬鐵蛋白一起催化N2還原為NH3[24]，關(guān)于ARTP誘變改變固氮酶活性的機(jī)制，需要進(jìn)一步研究探討。