張鵬博, 彭晴, 喬宇, 徐小輕, 張宇微, 田丹丹, 黃英, 馬藍, 石波

(中國農業(yè)科學院飼料研究所， 北京 100081)

硒是生命所必需的微量元素，具有參與機體免疫調節(jié)、預防癌癥、抗氧化等重要生理功能[1]。然而我國有三分之二的人口居住在缺硒或低硒地區(qū)[2]，且谷物、蔬菜、水果等天然食品中的硒含量較低，不能滿足機體對于硒的日常膳食需求。根據《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》[3]規(guī)定，成人硒推薦攝入量為50 μg·d-1，適宜攝入量為60 μg·d-1，可耐受最高攝入量為400 μg·d-1[3]。由于硒的生物活性范圍較為狹窄，硒攝入不足或過量都會導致不良后果。硒攝入不足會導致機體生長遲緩、甲狀腺功能異常[4]，還可能引起克山病、大骨節(jié)病[5]等；硒攝入過量則會引起硒中毒。因此，研究者們一直在致力于尋找一種具有高活性但低毒性的補硒方式。研究表明，硒主要有3種存在方式：①無機硒鹽，如Na2SeO4、Na2SeO3等；②有機硒，如硒蛋白、硒氨酸等；③納米硒，如紅色、灰色或者黑色形態(tài)的零價單質硒。已有研究表明，通過微生物法還原制備獲得的納米硒，與傳統(tǒng)化學方法合成的納米硒相比，尺寸更均勻，呈現規(guī)則的球狀，耐高溫，更穩(wěn)定，不易轉化成黑色或灰色納米硒[6]，更易于被機體吸收、毒性小，且具有無機硒鹽與有機硒共有的功能，如抗腫瘤、抗氧化、增強機體免疫力等[7]。因此，微生物法制備的納米硒是目前作為補硒制品的最佳選擇。

據報道，一些芽孢桿菌屬細菌能將Na2SeO3還原制備出納米硒[8-11]，如蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、芽孢桿菌HBS4(BacillusHBS4)等。但現有報道中制備納米硒的某些芽孢桿菌如蠟樣芽胞桿菌會產生毒素且有致病性，存在安全問題，所以尋找一些既安全又具備制備納米硒能力的菌種十分重要。近年來越來越多的芽孢桿菌屬菌種被納入益生菌范疇：如阿氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)在非洲刺槐豆種子發(fā)酵食品中作為發(fā)酵調味劑[12]，可產生靶向自誘導信號分子Autoinducer-2 ，促進食物在堿性條件下發(fā)酵[13]，可提高蝦對于弧菌病的先天性免疫與抗氧化活性[14]；解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)可改善腸道微生態(tài)環(huán)境、增強免疫力、降低養(yǎng)殖污染[15]；凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)可調節(jié)腸道內菌群平衡、促進營養(yǎng)物質代謝和利用、提高免疫力，此外還具有耐高溫、耐酸和耐膽鹽等特性，同時具有乳酸菌產乳酸的特性[16]。比起一些傳統(tǒng)的腸道益生菌，如乳桿菌、雙歧桿菌等，芽孢桿菌具有存活力強、培養(yǎng)方式簡單、生長快速等優(yōu)點，同時由于芽孢桿菌具有熱穩(wěn)定性，可以在食品、飼料、醫(yī)藥制品的加工環(huán)節(jié)中添加。因此，假如將益生芽孢桿菌還原制備納米硒的性能與其益生功效相結合，則服用少量的益生芽孢桿菌硒復合物，即可為人體補充足量的硒元素，且吸收效果好、毒性低，同時還能促進機體腸道健康，從多方面提高了機體免疫力，大大降低癌癥及其他多種病的患病率，提高生命質量。到目前為止，尚未有利用阿氏芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌合成納米硒的報道；雖然凝結芽孢桿菌有關于耐硒篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化報道[17]，但該研究并沒有對其合成納米硒能力進行全面分析；另外對于不同的芽孢桿菌菌株，其還原制備納米硒能力是否相同仍需進一步確定。

因此，本研究以阿氏芽孢桿菌SI9、解淀粉芽孢桿菌AT34和凝結芽孢桿菌LB-9為研究對象，研究其還原Na2SeO3制備納米硒的產率、Na2SeO3轉化率、納米硒提取率、純度及形貌表征等，篩選適合于制備納米硒的益生芽孢桿菌，為益生芽孢桿菌轉化無機硒及有益廉價硒源的研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1菌種阿氏芽孢桿菌SI9(Bacillusaryabhattai，CGMCC 16196)，由中國農業(yè)科學院飼料研究所功能碳水化合物課題組從廣西富硒大蒜中篩選獲得。解淀粉芽孢桿菌AT34(Bacillusamyloliquefaciens，CGMCC 15480)，由中國農業(yè)科學院飼料研究所功能碳水化合物課題組從健康仔豬糞便中篩選獲得。凝結芽孢桿菌LB-9(Bacilluscoagulans，CGMCC 1.10823)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑LB培養(yǎng)基：1% 氯化鈉、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物；改良LB培養(yǎng)基: 1% 氯化鈉、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%葡萄糖；LB或改良LB固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基基礎上，添加2%瓊脂。

胰蛋白胨、酵母提取物，購自英國Oxoid公司；氯化鈉，購自西隴科學股份有限公司；瓊脂粉，購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；正辛醇、十二烷基硫酸鈉，購自國藥集團化學試劑北京有限公司；氯仿、濃鹽酸、無水乙醇，購自北京化工廠；Tris，購自北京索萊寶生物科技有限公司；鹽酸羥胺、氟化鈉、草酸鈉、乙二胺四乙酸，購自天津市福晨化學試劑廠；2.5%戊二醛固定液，購自北京雷根生物技術有限公司；2,3-二氨基萘，購自麥克林公司。

1.1.3主要試驗儀器臺式離心機(SIGMA3K15，曦瑪離心機有限公司)，立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50FBS，上海申安醫(yī)療器械廠)，超凈工作臺(SW-CJ-2FD，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠) ，生化培養(yǎng)箱(ZXSD-R1090，上海智城分析儀器制造有限公司)，酶標儀(Epoch2，美國BioTek公司)，分析天平(AR2140，美國Ohaus公司)，恒溫振蕩器(THZ-D，太倉市實驗設備廠)，超聲波細胞粉碎機(SCIENTZ-ⅡD，寧波新芝生物科技股份有限公司)，冷凍干燥機(FD-1A-50，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)，日立冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SU8010，日本 Hitachi公司)。

1.2 種子液的制備

將保存在-20 ℃的菌株于固體平板上劃線，培養(yǎng) 24 h(阿氏芽孢桿菌SI9：LB培養(yǎng)基、30 ℃；解淀粉芽孢桿菌AT34：LB培養(yǎng)基、37 ℃；凝結芽孢桿菌LB-9：改良LB培養(yǎng)基、37 ℃)，用接種環(huán)挑取單菌落接種于各自對應的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 16～18 h，以質量體積比2%接種量接種于各自對應的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，得到菌株的種子液。

1.3 芽孢桿菌還原轉化Na2SeO3產物的提取

Na2SeO3產物的提取參照Mohammad等[18]的方法進行。分別將三株菌種種子液按體積分數1%接種量接種于200 mL含Na2SeO3200 μg·mL-1的液體培養(yǎng)基中，180 r·min-1培養(yǎng)36 h。將培養(yǎng)液4 000 r·min-1離心10 min，保留沉淀； 沉淀物用質量體積分數0.9% NaCl溶液洗滌；之后用濃HCl浸泡樣品24 h；離心去除濃HCl后加水洗滌，超聲破碎30 min；然后用含 1% SDS的1.5 mol·L-1Tris/HCl 緩沖液(pH 8.3)連續(xù)離心洗滌 3 次，沉淀物重懸于4 mL超純水中；加入2 mL正辛醇，劇烈搖晃， 2 000 r·min-1離心5 min后溶液分層，放入4 ℃冰箱靜置24 h； 產生的納米硒沉淀于離心管底部，細胞碎片懸浮于兩相之間， 將上層溶液用移液槍吸去，沉降的納米硒顆粒依次用氯仿、乙醇、和無菌水洗滌，最后將納米硒顆粒重懸于超純水中，保存于 4 ℃冰箱中，用于進一步表征和分析測定。

1.4 不同Na2SeO3濃度對菌株生長的影響

由于隨著培養(yǎng)時間的增加菌株發(fā)酵液逐漸變紅，本研究采用稱重法分別測定阿氏芽孢桿菌SI9、解淀粉芽孢桿菌AT34和凝結芽孢桿菌LB-9在不同濃度Na2SeO3培養(yǎng)基中的生長曲線，且由于Na2SeO3毒性較大，為確定不同Na2SeO3濃度對菌株生長的影響及在一定條件下的單質硒產率與Na2SeO3轉化率最高的Na2SeO3添加量，使Na2SeO3盡量不殘留，同時結合已有的通過細菌還原Na2SeO3為納米硒的研究報道中采用Na2SeO3濃度多為200 μg·mL-1左右，同時為了確定Na2SeO3濃度的提高對菌株生長、單質硒產率與Na2SeO3轉化率的影響，設置了200、300、400 μg·mL-13個Na2SeO3濃度。

用無菌水將菌株種子液的光密度值(OD600)調整到0.6左右，分別將三株菌液按體積分數1%接種量接種于含Na2SeO30、200、300、400 μg·mL-1的液體培養(yǎng)基中，180 r·min-1培養(yǎng)72 h，每隔一段時間，取出菌液5 mL，離心去上清后稱重，設置3個重復，以時間為橫坐標、重量為縱坐標，繪制生長曲線圖。計算不同菌株的初始生長速率與生長抑制率，初始生長速率即菌株生長曲線初始時的斜率，菌株生長抑制率計算公式如下。

(1)

1.5 不同芽孢桿菌制備納米硒能力比較

用無菌水將菌株種子液的光密度值(OD600)調整到0.6左右，分別將3株菌液按體積分數1%的接種量接種于含Na2SeO3200、300、400 μg·mL-1的液體培養(yǎng)基中，180 r·min-1培養(yǎng)72 h，每隔一段時間，取出菌液5 mL，12 000 r·min-1離心分離沉淀與上清，分別測定沉淀中納米硒含量和上清中Na2SeO3殘留量，同時設置空白對照(即不加Na2SeO3)，每個處理3次重復。分別以時間為橫坐標，納米硒產率與Na2SeO3轉化率為縱坐標，繪制曲線圖。

1.5.1Na2SeO3標準曲線的制作 參照Biswas等[19]方法，將10 mL 0.1 mol·L-1HCl、0.5 mL 0.1 mol·L-1EDTA、0.5 mL 0.1 mol·L-1NaF、0.5 mL 0.1 mol·L-1草酸鈉混在25 mL刻度試管中，分別加入0、50、100、150、200、250 nmol Na2SeO3，再加入2.5 mL含0.1% 2,3-二氨基萘的0.1 mol·L-1HCl(避光)，40 ℃水浴40 min，冷卻至室溫后加6 mL環(huán)己烷，劇烈搖晃1 min分層，377 nm測吸光度，3次重復。

1.5.2Se0標準曲線的制作 參照Kessi等[20]方法并有所改變。于試管中分別加入0、2、4、6、8、10 μmol Na2SeO3，再加入25 μmol NH2OH·HCl、1 mL Na2S，輕輕混勻，1 h后500 nm測吸光度，3次重復。

1.5.3樣品上清液中Na2SeO3含量的測定 取5 mL發(fā)酵液，離心后留上清，加100 μL上清液，其他操作同1.5.1 中Na2SeO3標準曲線的制作過程，根據吸光度來計算樣品上清液中Na2SeO3濃度，同時計算Na2SeO3轉化率，計算公式如下。

Na2SeO3轉化率=

(2)

1.5.4樣品沉淀中硒含量的測定取5 mL發(fā)酵液，離心后去上清，沉淀分別用1 mL 0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)洗滌，再用2 mL 1 mol·L-1NaCl洗兩次(5 000 r·min-1離心10 min)，加2 mL 1 mol·L-1Na2S，1 h后500 nm測吸光度，根據吸光度來計算樣品培養(yǎng)物中納米硒的量，同時計算納米硒產率，計算公式如下。

(3)

1.6 三株菌株提取納米硒的純度及提取率

分別將3株菌種種子液按體積分數1%接種量接種于200 mL含Na2SeO3200 μg·mL-1的培養(yǎng)基中， 180 r·min-1培養(yǎng)36 h，收集發(fā)酵液進行納米硒的提取，提取后冷凍干燥，并測定其硒含量，3次重復，方法與1.5.4相同，計算純度及提取率，計算公式如下。

(4)

(5)

1.7 場發(fā)射掃描電鏡觀察樣品形態(tài)

參考Saini等[21]的方法并有所改變。分別取1 mL菌體沉淀及提取的納米硒顆粒用 pH 7.4的PBS緩沖液洗滌3次。然后，加入1 mL的2.5%戊二醛固定液混勻，4 ℃過夜固定。水洗三次，分別浸泡4、5、6 min，然后，用梯度乙醇(50%、70%、85%和95%)進行連續(xù)脫水，每次14 min，最后用無水乙醇脫水3次，每次15 min。臨界點干燥，表面鍍金，掃描電鏡觀察。

1.8 數據統(tǒng)計與分析

試驗數據用Microsoft Excel 2010軟件進行整理和繪圖，用SPSS 13.0軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 三株益生芽孢桿菌還原制備紅色納米硒結果

注：1—阿氏芽孢桿菌SI9空白培養(yǎng)液；2—含200 μg·mL-1 Na2SeO3和阿氏芽孢桿菌SI9的培養(yǎng)液；3—解淀粉芽孢桿菌AT34空白培養(yǎng)液；4—含200 μg·mL-1 Na2SeO3和解淀粉芽孢桿菌AT34的培養(yǎng)液；5—凝結芽孢桿菌LB-9空白培養(yǎng)液；6—含200 μg·mL-1 Na2SeO3和凝結芽孢桿菌LB-9的培養(yǎng)液。

2.2 不同Na2SeO3濃度對益生芽孢桿菌生長的影響

不同Na2SeO3濃度不同芽孢桿菌的重量結果(圖2)可知，在24 h 之后，阿氏芽孢桿菌SI9在200、300、400 μg·mL-1Na2SeO3濃度下的重量較空白處理下降，而解淀粉芽孢桿菌AT34和凝結芽孢桿菌LB-9在不同Na2SeO3濃度下的重量與空白處理無差異。表明在較高Na2SeO3濃度條件下，阿氏芽孢桿菌SI9、解淀粉芽孢桿菌AT34和凝結芽孢桿菌LB-9對Na2SeO3均表現出較強的耐受能力。

圖2 Na2SeO3對三株益生芽孢桿菌菌株生長的影響

由表1可知，與空白對照相比，除阿氏芽孢桿菌SI9在Na2SeO3濃度為200 μg·mL-1時外，其余兩個菌株的生長均隨著Na2SeO3含量的增加而變緩， 說明Na2SeO3會抑制菌株生長，且濃度越高，抑制性越強。較高濃度的Na2SeO3雖然對上述三株芽孢桿菌的生長產生了一定的抑制作用，但細胞活性并沒有被完全殺死，菌株仍可以在高濃度的硒溶液下存活。其中，阿氏芽孢桿菌SI9在含200 μg·mL-1Na2SeO3培養(yǎng)基中生長速率加快，表明該菌的生長并未被低濃度Na2SeO3抑制，亦反映出該菌對于Na2SeO3的耐受能力較強。三株芽孢桿菌中，阿氏芽孢桿菌SI9在不同Na2SeO3濃度培養(yǎng)基中的生長抑制率比較穩(wěn)定，且生長抑制率均較低；而凝結芽孢桿菌LB-9的生長抑制率最高，Na2SeO3濃度為400 μg·mL-1時，生長抑制率達到100%；解淀粉芽孢桿菌AT34的生長抑制率居中。因此，對于高濃度Na2SeO3耐受能力最好的為阿氏芽孢桿菌SI9，凝結芽孢桿菌LB-9耐受力最差。

表1 不同Na2SeO3濃度下三株益生芽孢桿菌菌株的初始生長速率和生長抑制率

2.3 益生芽孢桿菌還原制備紅色納米硒能力比較

2.3.1Na2SeO3標準曲線與Se0標準曲線 為定量測定培養(yǎng)基中Na2SeO3含量以及微生物還原制備出的納米硒含量，分別作出Na2SeO3標準曲線和Se0標準曲線(圖3)。得到Na2SeO3的標準曲線方程為：y=0.001 6x-0.006 6，R2為0.996 8，得到的Se0標準曲線為：y=0.069 3x+0.003 9，R2為0.999 2。上述兩條標準曲線的R2值均大于 0.99，表明兩條標準曲線均具有良好的線性關系。

圖3 Na2SeO3和Se0的標準曲線

2.3.2不同Na2SeO3濃度下不同菌株的納米硒產率與Na2SeO3轉化率 由圖4可知， 當Na2SeO3濃度為200 μg·mL-1時，隨著培養(yǎng)的時間增加，阿氏芽孢桿菌SI9、解淀粉芽孢桿菌AT34和凝結芽孢桿菌LB-9的納米硒產率逐步增加，分別在24、24、36 h達到最高，產率分別為48.3%、36.3%、34.8%。Na2SeO3的轉化率也隨著培養(yǎng)時間的增加逐步升高，且在24 h時，三株菌株的Na2SeO3轉化率均達到100%，表明Na2SeO3已被完全還原，無殘留。

圖4 不同Na2SeO3濃度下三株菌株的納米硒產率和Na2SeO3轉化率

當Na2SeO3濃度為300 μg·mL-1時，隨著培養(yǎng)時間的增加，阿氏芽孢桿菌SI9、解淀粉芽孢桿菌AT34和凝結芽孢桿菌LB-9的納米硒產率逐步增加，分別在24、48、36 h達到最高，產率分別為21.1%、21.0%、21.1%。可見，當Na2SeO3濃度為300 μg·mL-1時，三株菌株的產納米硒能力差別不大，且阿氏芽孢桿菌SI9達到最高產率的用時最短。Na2SeO3轉化率也隨著培養(yǎng)時間的增加而逐步升高；且在72 h時，阿氏芽孢桿菌SI9、解淀粉芽孢桿菌AT34的Na2SeO3轉化率達到100%，表明Na2SeO3已被完全還原，無殘留；而凝結芽孢桿菌LB-9中Na2SeO3仍有少量殘留，Na2SeO3轉化率為97.0%。

當Na2SeO3濃度為400 μg·mL-1時，隨著培養(yǎng)時間增加，阿氏芽孢桿菌SI9、解淀粉芽孢桿菌AT34、凝結芽孢桿菌LB-9的納米硒產率逐步增加。72 h時，納米硒產率分別為23.2%、18.8%、18.0%。隨著培養(yǎng)時間增加， Na2SeO3的轉化率逐漸升高，但在培養(yǎng)結束時， Na2SeO3未被完全還原，有殘留，三株菌株的Na2SeO3轉化率分別為91.4%、86.8%、86.8%。

綜上，當增加Na2SeO3濃度時，三株菌株的納米硒產率并未增加，甚至在下降，過高的Na2SeO3濃度，導致Na2SeO3不能被完全還原，轉化率降低，同時產納米硒的速率也下降。由于Na2SeO3毒性較大，應盡量使其完全還原，不殘留。同時，培養(yǎng)時間為36 h時，三株菌株的納米硒產率已為最高。 所以選擇200 μg·mL-1為合適的Na2SeO3濃度，培養(yǎng)時間選擇36 h。此時，產納米硒能力最好的為阿氏芽孢桿菌SI9，解淀粉芽孢桿菌AT34和凝結芽孢桿菌LB-9次之。

2.3.3三株菌株提取納米硒的純度及提取率

從含200 μg·mL-1Na2SeO3的阿氏芽孢桿菌SI9、解淀粉芽孢桿菌AT34、凝結芽孢桿菌LB-9的培養(yǎng)液中提取納米硒顆粒，經冷凍干燥后稱重，質量分別為25.6、18.2、15.4 mg，其中的納米硒含量分別為18.74、14.22、13.76 mg。可得，阿氏芽孢桿菌SI9、解淀粉芽孢桿菌AT34和凝結芽孢桿菌LB-9提取的納米硒顆粒純度和提取率(圖5)。可見，凝結芽孢桿菌LB-9提取的納米硒純度最高，顯著高于解淀粉芽孢桿菌AT34和阿氏芽孢桿菌SI9；解淀粉芽孢桿菌AT34提取的納米硒純度顯著高于阿氏芽孢桿菌SI9。阿氏芽孢桿菌SI9的提取率最高，顯著高于解淀粉芽孢桿菌AT34和凝結芽孢桿菌LB-9，而后兩者之間無顯著差異。上述提取的紅色納米硒粉末，在室溫下放置1個月后，顏色基本不變，仍呈紅色，說明其穩(wěn)定性較好，不易被氧化為黑色或褐色納米硒。

注：不同小寫字母表示不同菌株間的差異在P<0.05水平具有顯著性。

2.4 場發(fā)射掃描電鏡觀察菌體和納米硒形貌

為確認阿氏芽孢桿菌SI9、解淀粉芽孢桿菌AT34和凝結芽孢桿菌LB-9菌體及納米硒的形貌，通過冷場發(fā)射掃描電鏡觀察菌株在不含或含Na2SeO3培養(yǎng)基中生長的情況。結果(圖6)顯示，在不含Na2SeO3培養(yǎng)基中生長的菌株細胞呈直桿狀，表面光滑，菌體周圍無顆粒物(圖6A、6D、6G)；當菌株在含200 μg·mL-1Na2SeO3培養(yǎng)基中生長時，發(fā)現在其細胞周圍出現了許多球狀顆粒，這些球狀顆粒不僅無規(guī)則地分布在細胞表面，而且有的散落在培養(yǎng)基上(圖6B、6E、6H)；而且從提取后的納米硒掃描電鏡圖(圖6C、6F、6I)可看出，提取獲得的硒顆粒呈規(guī)則的球狀顆粒，因此可判斷分布在菌體周圍的球狀顆粒為納米硒顆粒。通過測量掃描電鏡圖(圖6C、6F、6I)中的納米硒顆粒直徑發(fā)現，經阿氏芽孢桿菌SI9制備的納米硒顆粒尺寸分布在100～500 nm之間，經解淀粉芽孢桿菌AT34制備的納米硒顆粒尺寸分布在150～450 nm之間，經凝結芽孢桿菌LB-9制備的納米硒顆粒尺寸分布在70～500 nm之間。此外，還能看出在含200 μg·mL-1Na2SeO3培養(yǎng)基中生長的解淀粉芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌的菌體出現了輕微變形或破損現象(圖6E、6H)，推測可能是受到Na2SeO3毒性的影響，而阿氏芽孢桿菌的菌體并無明顯改變(圖6B)，這也與該濃度下Na2SeO3對菌株生長的抑制程度(表1)一致。從提取后的納米硒的掃描電鏡圖可看出，納米硒顆粒團聚現象明顯，其中還可看到夾雜著一些芽孢和細胞碎片。

A：空白培養(yǎng)基的阿氏芽孢桿菌SI9；B：含Na2SeO3培養(yǎng)基的阿氏芽孢桿菌SI9；C：阿氏芽孢桿菌SI9制備提取的納米硒；D：空白培養(yǎng)基的解淀粉芽孢桿菌AT34；E：含Na2SeO3培養(yǎng)基的解淀粉芽孢桿菌AT34；F：解淀粉芽孢桿菌AT34制備提取的納米硒；G：空白培養(yǎng)基的凝結芽孢桿菌LB-9；H：含Na2SeO3培養(yǎng)基的凝結芽孢桿菌LB-9；I：凝結芽孢桿菌LB-9制備提取的納米硒。

3 討論

近年來，隨著人們對于科學補硒的日益關注，利用微生物轉化Na2SeO3制備納米硒的研究非常多，研究涉及的微生物包括乳酸菌和芽孢桿菌類等細菌。李丹等[22]研究發(fā)現，沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)在Na2SeO3濃度為1 mmol·L-1(173 μg·mL-1)時的Na2SeO3轉化率為100%，在Na2SeO3濃度為2 mmol·L-1(346 μg·mL-1)時的Na2SeO3轉化率則降為80%。本研究中，阿氏芽孢桿菌SI9、解淀粉芽孢桿菌AT34和凝結芽孢桿菌LB-9在Na2SeO3濃度為200 μg·mL-1時Na2SeO3轉化率均為100%；在Na2SeO3濃度為300 μg·mL-1時，三者的Na2SeO3轉化率分別為100%、100%、97%；在Na2SeO3濃度為400 μg·mL-1時，三者的Na2SeO3轉化率分別為91.4%、86.8%、86.8%。隨著Na2SeO3濃度的升高，上述菌株的Na2SeO3轉化率均逐漸下降。然而，可以發(fā)現三株益生芽孢桿菌在高Na2SeO3濃度下的轉化能力均高于沼澤紅假單胞菌。說明阿氏芽孢桿菌SI9、解淀粉芽孢桿菌AT34與凝結芽孢桿菌LB-9的轉化Na2SeO3能力較強，若是經過培養(yǎng)優(yōu)化后，其轉化能力應該能有所提升。由于Na2SeO3毒性較大，在微生物轉化合成納米硒的過程中，應盡量提高Na2SeO3轉化率，因此需要選擇合適的Na2SeO3濃度。本研究發(fā)現，阿氏芽孢桿菌SI9、解淀粉芽孢桿菌AT34和凝結芽孢桿菌LB-9的合適Na2SeO3濃度為200 μg·mL-1，此濃度下Na2SeO3轉化率均為100%，且其納米硒產率也未較300、400 μg·mL-1Na2SeO3濃度的產率低。

本研究中，阿氏芽孢桿菌SI9、解淀粉芽孢桿菌AT34和凝結芽孢桿菌LB-9對于低濃度Na2SeO3的轉化率均能達到100%，然而其納米硒產率卻不足50%，說明其轉化的大部分Na2SeO3可能以有機硒形式存在，如何提高Na2SeO3轉化為納米硒的效率，仍需深入研究。而且隨著時間的增加，納米硒產率有下降的趨勢，可能是因為菌株又將單質硒轉化為其他硒形式，具體仍需進一步研究。此外，本研究提取的納米硒顆粒純度不高，其中包含一些細胞碎片和芽孢，仍需要改進方法來提高其提取純度。 Xu等[23]利用干酪乳桿菌制備的納米硒粒徑在50～80 nm之間； Eszenyi等[24]利用乳酸菌制備的納米硒粒徑在100～500 nm之間；劉紅芳[25]利用乳酸菌LA4制備的納米硒粒徑在50～200 nm 之間；周馳[26]采用生防菌枯草芽孢桿菌制備納米硒粒徑在50～250 nm。本研究制備的納米硒顆粒尺寸在70～500 nm之間，與已有報道結果一致。

通過益生芽孢桿菌將高毒性的Na2SeO3轉化為低毒性且生物利用率高的納米硒和有機硒，將是一種更為科學的補硒趨勢。這樣一方面可以起到補硒的作用，另一方面芽孢桿菌本身帶有的益生菌功效將對腸道健康起到促進作用。本研究選用的三株益生芽孢桿菌中，阿氏芽孢桿菌SI9比解淀粉芽孢桿菌AT34和凝結芽孢桿菌LB-9表現出顯著的優(yōu)越性。然而作為一種食品或飼料添加劑，其本身以及合成的納米硒對于人或者動物的毒性以及毒副作用需要更為全面的檢測和評估，對于阿氏芽孢桿菌SI9的發(fā)酵優(yōu)化也需要進一步研究。