李愛花, 蔣順媛, 郭娜, 黃璐琦

(1.北京市植物園, 北京市花卉園藝工程技術(shù)研究中心, 北京 100093; 2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心, 國家道地藥材重點實驗室培育基地, 北京 100700; 3.四川省中藥科學(xué)研究院, 四川省中藥質(zhì)量和創(chuàng)新研究重點實驗室, 成都 610041; 4.中國中醫(yī)科學(xué)院實驗研究中心, 北京 100700)

羌活(NotopterygiumincisumTing ex H.T. Chang)傘形科(Umbelliferae)羌活屬(Notopterygium)植物，為我國特產(chǎn)，多年生草本，生長于海拔2 000—4 000 m的林緣及灌叢內(nèi)。羌活為我國傳統(tǒng)大宗藥材，以根及根莖入藥，主治外感風(fēng)寒、頭痛無汗、寒濕痹、上肢風(fēng)濕疼痛。長期以來，羌活藥材資源主要依靠采挖野生資源為主，導(dǎo)致羌活資源已經(jīng)處于近危狀態(tài)[1]。目前，羌活已被甘肅省、西藏自治區(qū)、寧夏自治區(qū)列為省級重點保護藥用植物[2-4]。為了保證其在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，亟需對其進行人工馴化栽培。

由于羌活種子存在形態(tài)生理休眠，自然發(fā)芽率低，休眠期長，限制了羌活的人工馴化和栽培種植，導(dǎo)致其人工種植發(fā)展緩慢。羌活種子成熟脫落時，胚未發(fā)育完全，需要待胚發(fā)育完全后，再進行低溫處理才能解除休眠，最終萌發(fā)[5]。楊旻[6]研究發(fā)現(xiàn)，低溫層積能夠明顯解除羌活的種子休眠。

近年來，一些學(xué)者利用代謝組學(xué)解析作物種子發(fā)育、萌發(fā)過程的代謝物變化[7-11]，但對于種子休眠解除過程的代謝組學(xué)分析少見，且對于羌活種子休眠解除的代謝機理研究還未見報道。本研究通過對不同休眠解除階段的羌活種子進行取樣，利用UPLC(ultra performance liquid chromatography)對其進行代謝物質(zhì)變化分析，以解析羌活種子休眠解除過程的物質(zhì)代謝變化規(guī)律，并試圖找出種子休眠解除的關(guān)鍵化學(xué)物質(zhì)，以期為羌活的人工馴化栽培提供理論背景，為具相似休眠特征植物種子的栽培種植提供重要理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

羌活(N.incisum)種子采自四川省甘孜藏族羌族自治州小金縣。

瓊脂為分析純，氟啶酮(fluridone，F(xiàn)L)、赤霉素(gibberellin 3，GA3)均為分析純，均購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1預(yù)處理成熟干種子1∶1拌細河沙，在15/5 ℃條件下，進行暖-冷層積預(yù)處理，以完成羌活種子胚的生長，即解除其形態(tài)休眠(morphological dormancy，MD)。預(yù)處理過程中，每隔15 d取樣20粒，直至150 d結(jié)束。取樣種子在奧林巴斯解剖鏡(SZX7，日本奧林巴斯)下進行解剖、形態(tài)觀察及拍照；并進行胚長和種子長的測量。同時將部分種子速凍后保存在-80 ℃冰箱。選取預(yù)處理0(0MD)、15(1MD)、60(3MD)、90(5MD)、120(7MD) d進行后續(xù)檢測。

胚率=胚長/種子長×100%

(1)

1.2.2生理休眠(physiologicaldormancy，PD)解除處理將經(jīng)過預(yù)處理的種子進行以下4種處理：分別用蒸餾水(對照，CK)、100 mg·L-1氟啶酮(FL)、400 mg·L-1赤霉素(GA)浸泡24 h后，流水沖洗，播種到1%瓊脂培養(yǎng)基。另將部分種子繼續(xù)進行5 ℃混沙低溫處理(cold stratification, CS)3個月，分別在預(yù)處理+低溫層積(CS)150 d(0PD)、150+30 d(3PD)、150+ 60 d(5PD)、150+110 d(10PD)進行取樣。低溫層積結(jié)束的種子播種到1%瓊脂培養(yǎng)基觀察種子萌發(fā)情況，萌發(fā)試驗每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)100粒種子。萌發(fā)條件如下：15 ℃，光照12 h/黑暗12 h，光源為冷光源，1 000 lx。 每隔一周觀察一次種子萌發(fā)情況。同時，將休眠解除處理0PD(CK)、FL、GA和CS 4個處理的種子取樣，速凍保存在-80 ℃冰箱，進行后續(xù)代謝物檢測分析。

1.3 代謝物檢測

利用UPLC-MS/MS平臺檢測羌活種子內(nèi)代謝物。提取檢測方法參考Evans等[12]，并稍作修改，簡要描述如下：將儲藏在-80 ℃的樣品研磨成粉。稱取0.1 g研磨樣品，加入到1 mL甲醇，超聲提取30 min。離心取上清液，反復(fù)提取3次，合并提取液。氮氣吹干，真空干燥。50 μL甲醇超聲溶解，上機檢測。

色譜條件：Waters Acquity UPLC-I-Class system (Waters Corporation, Milford, MA)，Acquity BEH C18色譜柱，柱溫40 ℃，流速350 μL·min-1。流動相：0.1%甲酸水為水相，甲醇為有機相。線性洗脫梯度：(0—0.5) min，100%水；(0.5—6.0) min，60%甲醇；(6.0—6.5) min， 98%甲醇；(6.5—8.0) min，100%甲醇；進樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，采取ESI (+)離子模式，離子源溫度分別為100 ℃和450 ℃，毛細管電壓分別為0.5 kV和2 kV，錐孔電壓為40 V，低能量碰撞電壓6 eV，高能量碰撞電壓分別為6 590 eV和40～70 eV。掃描范圍 質(zhì)荷比50～1 000 m·z-1。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Origin 8.0的Boltzmann模型進行羌活種子胚的生長曲線擬合。代謝物檢測數(shù)據(jù)用Progenesis QI軟件進行分析。原始數(shù)據(jù)進行Z-score歸一化處理后，用SPSS 11.0進行PCA和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羌活種子預(yù)處理過程的內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化

圖1顯示，羌活種子成熟散布時，種子內(nèi)部大部分為胚乳，僅在果疤一端有一團未分化的透明物質(zhì)為原胚， 0.1～0.2 mm，原胚的頂端有1個白色胚結(jié)構(gòu)。在形態(tài)休眠解除的處理過程中，胚不斷長大，至150 d時，胚長至約為種子長度的三分之二，胚乳軟化。在胚發(fā)育過程中，隨著處理時間的推移，胚率的變化表現(xiàn)為S曲線，處理80 d左右時，胚率的變化速度最快，即羌活種子的胚生長最快，這是加速胚發(fā)育速度的關(guān)鍵時間點。

A：種子休眠解除處理過程；B：關(guān)鍵時間點的胚形態(tài)；C：胚生長曲線

2.2 羌活種子預(yù)處理過程的代謝組分析

對羌活種子的整個預(yù)處理及低溫層積過程取樣，進行代謝物檢測。對正離子模式原始檢測結(jié)果歸一化處理后，進行H聚類分析，結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，0MD、1MD、3MD聚類到一組，5MD、7MD、0PD、3PD聚類到一組，而5PD、10PD聚類到一組?？梢姡傮w來看，在羌活種子的整個處理過程中，種子內(nèi)化合物的代謝模式，分為3個階段：0—60 d、90—(150+30) d和(150+60)—(150+110)d。其中第3個階段的兩個處理5PD和10PD的羌活種子已具備萌發(fā)能力，5PD的種子通過ABA抑制劑處理已可以萌發(fā)，而10PD的種子可以直接萌發(fā)[13]。而0PD、3PD甚至之前處理階段的羌活種子不萌發(fā)，且經(jīng)過氟啶酮處理后也基本不萌發(fā)。

注：色度條表示代謝物的豐度，以相對于所有處理平均值的變化來表示。

對檢測結(jié)果進行PCA分析，結(jié)果見圖3?？梢?，羌活種子處理整個過程的不同階段可以有很好的區(qū)分度，隨著時間的推移，不同處理的代謝物表現(xiàn)出順時針的旋轉(zhuǎn)模式，0MD、1MD、3MD、5MD、7MD沿著t[1] 主成分軸由小到大排列，0PD、3PD、5PD、10PD按照t[2] 主成分軸由大到小排列。即t[1] 主成分所代表的化合物能夠很好地將0MD、1MD、3MD、5MD、7MD區(qū)分開，而t[2]主成分所代表的化合物對0PD、3PD、5PD、10PD能夠很好地分開。那么，t[1]、t[2]主成分所代表的化合物即是這些處理之間發(fā)生代謝變化的關(guān)鍵化合物。

圖3 羌活種子處理過程代謝物的PCA分析

2.3 羌活種子休眠解除處理的代謝組分析

對羌活種子休眠解除處理的代謝物檢測結(jié)果進行PCA分析，結(jié)果(圖4)顯示，對完成形態(tài)休眠羌活種子進行的休眠解除處理(5PDFL、5PDGA和10PD)的代謝物的PCA分析結(jié)果，與5PD處理可以顯著區(qū)分。而3個解除休眠處理間，5PDFL與5PDGA和10PD可以明顯區(qū)分，但是5PDGA與10PD不能區(qū)分。t[1] 主成分所代表的化合物能夠很好地將5PD、5PDFL、5PDGA和10PD區(qū)分開，而不能將5PDGA和10PD 區(qū)分。萌發(fā)試驗顯示，5PDFL和10PD的種子可以萌發(fā)[13]，而5PDGA的種子萌發(fā)率很低(未發(fā)表)。

圖4 休眠解除過程羌活種子代謝物的PCA分析

2.4 羌活種子休眠解除處理的關(guān)鍵化合物

通過分析可萌發(fā)處理5PDFL和10PD的共有代謝物，及二者與不能萌發(fā)處理(5PD)的差別代謝物，結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn)，正離子模式的加荷粒子 411.1607：[M+Na]+和389.1416：[M+H]+，碎片離子包括307: [M+Na-CH3COOH-CO2]+、351: [M + Na-CH3COOH]+、335: [[M+Na-CH3CO-H2O]+和371: [M+H-H2O]+。表明該化合物的分子式可能為C31H42O17。負離子模式的質(zhì)譜圖，顯示加荷粒子387.1652：[M-H]-，表明該化合物的經(jīng)驗分子式為C31H42O17。這與獨腳金內(nèi)酯(strigolactones，SLs)化合物列當(dāng)醇乙酸酯(orobanchyl acetate)的分子式一致(圖6)。 離子片斷分析表明，列當(dāng)醇乙酸酯脫下一個糖基和1個分子H2O (180 Da)?；赨PLC-MS/MS檢測的列當(dāng)醇乙酸酯的峰面積，計算5PDFL和10PD處理相對于5PD的列當(dāng)醇乙酸酯變化，發(fā)現(xiàn)FL和CS處理的列當(dāng)醇乙酸酯水平分別顯著升高12.1和 28.5倍(圖7)。

圖5 羌活種子中列當(dāng)醇乙酸酯的質(zhì)譜圖

圖6 列當(dāng)醇乙酸酯的結(jié)構(gòu)式

圖7 羌活種子中列當(dāng)醇乙酸酯的含量變化

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，完成形態(tài)發(fā)育的羌活種子胚仍然不能萌發(fā)，低溫層積3個月(CS)處理可以達到73.5%的萌發(fā)率；用氟啶酮溶液(FL)浸泡后，也可以達到81.3%的萌發(fā)率；不經(jīng)過處理的種子(Con)僅有12.8%萌發(fā)；GA3溶液浸泡(GA)的種子萌發(fā)情況與未處理(Con)種子萌發(fā)情況類似[13]?？梢姡蓟罘N子通過預(yù)處理完成種子胚的發(fā)育，但是發(fā)育完全的胚仍然不能全部萌發(fā)，需要通過低溫層積3個月解除休眠而萌發(fā)，氟啶酮也可以有效解除完成胚發(fā)育種子的休眠。

本研究對羌活種子取樣進行代謝物檢測后發(fā)現(xiàn)，羌活種子整個處理過程分為3個階段：0—60 d(0MD、1MD、3MD)、90—180 d(5MD、7MD、0PD、3PD)、210—260 d(5PD、10PD)，第三個階段的兩個處理5PD和10PD種子已具備萌發(fā)能力。t[1] 主成分所代表的化合物能夠很好地將形態(tài)休眠階段(即0MD、1MD、3MD、5MD、7MD)區(qū)分開，表明這些化合物是0MD、1MD、3MD、5MD、7MD胚發(fā)育處理過程發(fā)生主要變化的化合物。t[2] 主成分所代表的化合物對生理休眠階段(0PD、3PD、5PD、10PD)很好地區(qū)分，表明這些化合物主要是在生理休眠解除過程中發(fā)生變化的。而t[1]、t[2]主成分所代表的主要代謝化合物的分析鑒定，還需要進一步研究。

獨腳金內(nèi)酯是一種來源于類胡蘿卜素的植物激素，能夠誘導(dǎo)寄生植物Orobanchesp.和Strigasp.種子萌發(fā)[14]，促進叢枝真菌分枝、抑制地上分枝的作用[15]，然而其是否能夠誘導(dǎo)非寄生植物的種子萌發(fā)，尚未見有報道。本研究發(fā)現(xiàn)，在ABA抑制劑(FL)處理和低溫層積處理誘導(dǎo)羌活種子休眠解除過程中，列當(dāng)醇乙酸酯，一種SLs化合物，發(fā)生顯著積累。FL處理后SLs的生物合成水平升高12.1倍，顯著低于CS處理后SLs的合成水平升高倍數(shù)(28.5倍)。推測FL處理抑制八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)活性[16]，也降低了種子休眠解除過程SLs的生物合成水平。Li等[13]研究也發(fā)現(xiàn)，SLs的合成酶基因NiD27、NiCCD8、NiCYP711A1和NiDAD2在5PDFL和CS處理中均顯著上調(diào)表達。因此，推測SLs的含量變化可能是羌活種子休眠解除過程是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。