胡婷婷, 王健康, 丁成偉, 郭榮良, 吳玉玲,徐家安, 王友霜, 趙軼鵬, 何彎彎

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學研究所, 江蘇 徐州 221121)

種子發(fā)育始于雙受精，主要包括胚和胚乳的發(fā)育以及種子的成熟，發(fā)育過程主要包括胚的不斷增長和胚乳的細胞化。因此，不僅有大量基因直接參與調(diào)控胚和胚乳的發(fā)育，還有大量調(diào)節(jié)因子形成精細復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)協(xié)同調(diào)控種子發(fā)育。禾谷類種子中的淀粉積累量決定了種子的大小和重量，這與產(chǎn)量、品質(zhì)密切相關(guān)。因而研究種子發(fā)育的調(diào)控機制，結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)手段利用人類需要的等位突變，對提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。本文詳細綜述了調(diào)控種子發(fā)育的基因及影響種子發(fā)育的因素，以期為植物種子發(fā)育調(diào)控、調(diào)控種子發(fā)育新基因的鑒定、糧食產(chǎn)量性狀遺傳改良等相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 調(diào)控種子發(fā)育的基因

種子發(fā)育受多個基因的精細協(xié)同調(diào)控，SHORTHYPOCOTYLUNDERBLUE1(SHB1)、HAIKU1(IKU1)、MINISEED3(MINI3)和HAIKU2(IKU2)啟動胚和胚乳的發(fā)育，正調(diào)控種子的大小[1-2]。IKU1、MINI3和IKU2是IKU途徑中的關(guān)鍵基因，在種子發(fā)育早期誘導(dǎo)胚乳的發(fā)育，突變后抑制游離核時期胚乳核的增殖，使得胚乳發(fā)育提前終止，最終導(dǎo)致種子變小。IKU1含有QV motif，其和MINI3直接互作，SHB1增強胚細胞的分化和增殖，是一個正調(diào)節(jié)子[1]。相反，擬南芥的APETALA2(AP2)基因則通過控制胚的細胞數(shù)目和細胞大小負調(diào)控胚珠和種皮的發(fā)育，從而影響種子的大小[3]。擬南芥中的鈣調(diào)蛋白CML39抑制營養(yǎng)組織中種子成熟相關(guān)基因的表達，cml39突變體角果變短，每個角果內(nèi)種子數(shù)目變少[4]。擬南芥中的亮氨酸重復(fù)序列類受體蛋白激酶EMS1及其小蛋白質(zhì)配體TPD1是花藥分化必需的蛋白，在玉米中其同源基因參與調(diào)控孢子母細胞分化，在水稻中則影響胚珠發(fā)育。異位表達TPD1不僅改變了植物對生長素的響應(yīng)，同時也影響胚珠中細胞周期基因CYCD3;3和CYCA2;3的表達，調(diào)控種子的發(fā)育[5]。MADS29是MADSbox家族的一員，在胚珠中高表達，通過調(diào)節(jié)母體組織的PCD(programmed cell death)過程來調(diào)控種子的發(fā)育，該基因突變后，種子皺縮、變小[6]。

淀粉是禾谷類種子胚乳的主要組成部分，當?shù)矸酆铣墒艿接绊懞?，種子大小、形態(tài)都會發(fā)生變化。水稻中鑒定出一大批暗色、糖質(zhì)、皺縮和粉質(zhì)等淀粉合成受阻的突變體，這些突變體不僅使淀粉合成有缺陷，還會導(dǎo)致種子大小和形態(tài)都發(fā)生變化。OsAGPS2和OsAGPL2功能缺失突變體(shr1)，錯義突變體(shr1a)胚乳中淀粉積累顯著減少，形成種子胚乳皺縮表型[7]。FSE1編碼一個含DDHD結(jié)構(gòu)域的蛋白，該蛋白與磷脂水解酶A1(PA-PLA1)同源，具有磷脂水解酶活性，突變體fse1胚乳中磷脂組分及其含量發(fā)生改變，種子皺縮不透明，成熟種子的千粒重顯著下降[8]。Flo16編碼一個由332個氨基酸組成的胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶，該基因突變后，蘋果酸脫氫酶活性降低，主要淀粉合成酶的活性均受到影響，成熟的突變體種子中央完全不透明，并且整個籽粒外表略微皺縮，種子發(fā)育有明顯缺陷[9]。

2 種子發(fā)育的影響因素

除了直接影響種子發(fā)育的基因以外，還有其他基因參與這個復(fù)雜的過程，包括與線粒體功能相關(guān)的亞基、PPR蛋白、激素、基因組印記、泛素化途徑的相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、細胞周期蛋白、溫度、光照等相關(guān)因素(表1)，都會影響種子的發(fā)育。

表1 與植物種子發(fā)育相關(guān)的基因

2.1 線粒體基因功能受損影響種子發(fā)育

線粒體基因的突變、異常剪切和編輯都會導(dǎo)致線粒體功能異常，引起呼吸通量的改變和能量供應(yīng)不足，從而導(dǎo)致種子的胚和胚乳發(fā)育缺陷。線粒體核心亞基的突變和附屬亞基的突變均會造成胚體細胞和胚乳發(fā)育受阻，形成不育或者不能萌發(fā)的種子。NDUFV1和NDUFS4分別編碼擬南芥中線粒體復(fù)合體I中的催化亞基和附屬亞基，這2個基因突變后，植株發(fā)育變緩。突變體ndufv1、ndufs4氧化磷酸化效率降低，ATP合成減少，種子大小和萌發(fā)均受到影響[10]。水稻中OsNDUFA9編碼線粒體復(fù)合體I的1個附屬亞基，該基因突變后線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)損傷，線粒體嵴的結(jié)構(gòu)被破壞，線粒體和淀粉合成相關(guān)基因的表達和蛋白積累量也被改變，從而產(chǎn)生胚致死和粉質(zhì)胚乳表型[11]。INDH是線粒體復(fù)合體I必需的一個鐵硫蛋白，其編碼基因突變后線粒體蛋白COX2、Nad7和Nad6蛋白水平下降，indh突變體種子不能萌發(fā)或幼苗期死亡[12]。線粒體轉(zhuǎn)位酶TIM9和TIM10位于線粒體膜間隙，BIFC試驗表明，擬南芥中的AtTIM9和AtTIM10可能形成一個TIM9:10復(fù)合物，并無冗余地執(zhí)行其功能。線粒體蛋白Tim9和Tim10的缺失導(dǎo)致線粒體異常釋放細胞色素c，啟動胚中的胚體細胞和胚乳發(fā)生細胞程序性死亡，突變體早期胚與胚乳停止分裂并死亡[13]。

PPR蛋白是一種由低度保守的31～36個氨基酸基序重復(fù)串聯(lián)組成的蛋白質(zhì)，在線粒體中主要參與線粒體基因的編輯、剪切和穩(wěn)定性的維持等。當線粒體復(fù)合體相關(guān)基因的編輯、剪切和穩(wěn)定性發(fā)生改變后也會導(dǎo)致線粒體功能受損，能量供應(yīng)受限，從而影響胚和胚乳的發(fā)育。玉米中多個籽?？掌け硇陀捎赑PR蛋白的缺失或突變引起，這些PPR突變體中，大多表現(xiàn)為胚乳傳遞細胞(basal endosperm transfer layer，BETL)發(fā)育受阻，能量供應(yīng)受到影響，導(dǎo)致種子空皮表型或者畸形。EMP7編碼E亞家族的PPR蛋白，影響細胞色素C成熟相關(guān)蛋白ccmFN的編輯[14]；編碼E+亞家族的PPR蛋白的EMP9基因突變后，線粒體基因ccmB和rps4不能被正常編輯[15]；EMP16編碼P型PPR蛋白，影響nad2第4個內(nèi)含子的順式剪切[16]。這些PPR基因的突變大多造成線粒體復(fù)合體的組裝缺陷，影響能量供應(yīng)和養(yǎng)分傳遞，最終導(dǎo)致籽粒的胚和胚乳發(fā)育缺陷，形成空皮表型。DEK35編碼的PPR蛋白影響線粒體基因nad4第1個內(nèi)含子的順式剪切，玉米dek35-ref突變體中BETL發(fā)育受阻，影響能量供應(yīng)，導(dǎo)致成熟種子籽粒扁小，胚和胚乳皺縮，表現(xiàn)為籽粒發(fā)育缺陷，且種子不育[17]。

II型內(nèi)含子是存在于線粒體中的一類內(nèi)含子，其正常剪切需要核編碼的成熟相關(guān)蛋白(nMAT)參與，擬南芥中的nMAT基因突變后，線粒體復(fù)合體活性下降。II型內(nèi)含子的順式剪切異常，種子變小、畸形或者不育[18-19]。nMAT1參與nad1第1個內(nèi)含子的剪切，基因突變后種子不育[19]；nMAT4基因參與nad1前體RNA的成熟[18]。P亞家族的PPR蛋白SLO3負責線粒體基因nad7第2個內(nèi)含子的剪切，SLO3基因突變后種子顏色變深、皺縮[20]。COD1是線粒體E/E+家族的PPR蛋白，負責cox2-253、cox2-698及nad4-1129位點的編輯，該基因突變后胚發(fā)育至子葉期后不再分化，種子發(fā)育受阻[21]。

此外，水稻中也鑒定出一批PPR蛋白，比如OsSMK1編碼的PPR蛋白參與線粒體基因nad7的編輯，當OsSMK1突變后，種子發(fā)育異常，淀粉合成受阻，成熟種子表現(xiàn)粉質(zhì)不透明[22]，這類相關(guān)的PPR蛋白通過對線粒體基因的編輯或剪切等影響淀粉的合成和積累[17,23]。FLO10編碼一個P亞家族的PPR蛋白，定位于線粒體中，該蛋白的突變影響了線粒體復(fù)合體I亞基nad1第1個內(nèi)含子的反式剪切，同時伴有nad1外顯子1和外顯子2～5前體積累的增加，引起線粒體功能受損，從而影響胚乳發(fā)育[23]。OsNPPR1是一個核定位的P亞家族的PPR蛋白，OsNPPR1突變后線粒體功能受損，與野生型相比，突變體fgr1成熟種子粒長和粒寬未受影響，但粒厚減小，千粒重顯著下降[24]。

2.2 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響種子發(fā)育

植物激素是植物自身代謝產(chǎn)生的一類特殊的微量存在的小分子。生長素(auxin)、細胞分裂素(cytokinin，CTK)、油菜素內(nèi)酯(brassinolide，BR)和赤霉素(gibberellic acid，GA)等均在種子發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用[46-50]。激素的正常分布和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對胚和胚乳的發(fā)育至關(guān)重要。因此，激素生物合成相關(guān)基因、激素受體因子、受激素調(diào)控且與種子發(fā)育相關(guān)基因的突變、被修飾或者表達量的改變是影響植物種子發(fā)育的重要因素。

生長素參與調(diào)控胚最終的結(jié)構(gòu)和大小。受精后的胚珠在發(fā)育過程中會富集生長素，生長素啟動胚乳發(fā)育過程中中央細胞的分裂和胚乳的細胞化[49]，并影響種子大小。生長素生物合成中，黃素單加氧酶YUCC(YUC)對雙受精后胚胎的發(fā)生和器官分化有重要作用，擬南芥yuc1、yuc4、yuc10、yuc11四缺突變體不能形成正常的下胚軸和根分生組織[25]。在水稻中，Bg1-D參與生長素的運輸和分布，過表達Bg1-D可顯著增加種子大小[26]。PIN是一類調(diào)節(jié)生長素極性運輸?shù)牡鞍?，PIN的結(jié)構(gòu)或構(gòu)象發(fā)生改變會影響生長素在胚中的有序分布，影響胚細胞的正確分裂[27,51]。ENP(enhancer of pinoid)則是絲氨酸/蘇氨酸激酶PINOID的增強子，其通過與PID協(xié)同控制PIN1極性，從而特異性調(diào)控子葉發(fā)育[27]。另外，一些生長素應(yīng)答因子也參與了種子發(fā)育調(diào)控，如MNT編碼的ARF2是受生長素調(diào)節(jié)的細胞分裂的抑制子，通過結(jié)合生長素響應(yīng)元件(AuxRE)調(diào)控響應(yīng)生長素相關(guān)基因表達，該基因突變后種子大小和重量均大于野生型[28]。

細胞分裂素(CTK)能促進細胞分裂，影響細胞周期，對胚后期器官分化和種子發(fā)育起著重要作用，影響莖端分生組織的分裂和活性[52]。細胞分裂素氧化酶是調(diào)節(jié)CTK在植物體內(nèi)分解代謝的關(guān)鍵酶類，其在胚乳合胞體中高表達，能降解內(nèi)源CTK。IKU途徑的轉(zhuǎn)錄因子WRKY10與CKX2直接結(jié)合，啟動胚乳的生長，最終影響種子發(fā)育[29]。細胞分裂素受體能與植物激素專一地結(jié)合，通過識別激素信號，參與植物的生理生化過程。擬南芥組氨酸激酶是細胞分裂素的受體，不僅影響根尖分生組織，還參與到胚的發(fā)育，ahk2-5、ahk3-7、cre1-2三突變的種子和胚均顯著增大，約為野生型2～3倍[30]。

BR在植物雙受精和種子發(fā)育過程中也承擔重要角色，BR缺陷型和不敏感型突變體的種子變小[32,48]。與野生型相比，擬南芥弱BR缺陷型突變體det2(de-etiolated2)育性低，強BR缺陷型突變體dwarf4(dwf4)和cpd則完全雄性不育[31]。水稻中BR缺陷型突變體種子長度變小[32,53]，過表達BR生物合成相關(guān)基因能增加種子長度，提高產(chǎn)量潛力[54]。除BRI1、BZR1和BES1調(diào)控大部分響應(yīng)BR相關(guān)基因的表達[32]，OFP1則是水稻中另一個和DLT互作，且受BR誘導(dǎo)調(diào)節(jié)種子形態(tài)的蛋白[33]。

GA、ABA、獨腳金內(nèi)酯等激素也參與調(diào)控種子的發(fā)育，影響作物產(chǎn)量[34,55]。赤霉素和E3泛素連接酶共同作用，調(diào)控種子發(fā)育[56]；擬南芥中，bZIP蛋白ABI5(ABA-INSENSITIVE 5)，ABA響應(yīng)原件綁定蛋白AREB3、AtbZIP67/AtDPBF2 和 EEL一樣，參與ABA應(yīng)答和響應(yīng)，主要在種子中表達，參與種子發(fā)育的表達調(diào)控；D53是SL信號通路的抑制因子，利用不同濃度的磷酸鹽處理野生型和d(darf)和d53突變體，結(jié)果表明，與野生型相比，d突變體的穗數(shù)和空癟粒率增加，但結(jié)實率降低，千粒重下降[34]。

2.3 表觀遺傳調(diào)控胚乳發(fā)育

表觀遺傳是指基因表達或表型的改變可通過有絲分裂或減數(shù)分裂遺傳，但沒有DNA序列的變化，主要受基因組印記調(diào)節(jié)。胚乳的發(fā)育與表觀遺傳學調(diào)控密切相關(guān)，通過DNA甲基化、組蛋白甲基化、基因組印記和siRNA(small interfering RNA)等多種方式來實現(xiàn)[35-38,57-58]?；蚪M印記基因通過調(diào)控胚乳細胞分裂、生長及調(diào)節(jié)養(yǎng)分運輸來調(diào)控種子發(fā)育。聚梳蛋白(PcG)復(fù)合體參與種子發(fā)育的多個過程[35-36]，其中MEA、FIS2和FIE基因的研究較為深入，是胚乳發(fā)育的主要調(diào)控基因。MEA和FIE互作形成FIS復(fù)合體，通過調(diào)節(jié)胚乳中大量印記基因的表達，影響細胞的增殖和分化，從而影響胚乳的發(fā)育。OsFIE1和OsFIE2是水稻中2個重要的PcG蛋白，與擬南芥相似，OsFIE1和MEA的同源基因OsCLF、OsIEZ1互作，OsFIE1通過影響能量養(yǎng)分供應(yīng)和H3K27me3的基因組修飾調(diào)控種子發(fā)育。OsFIE1突變后，種子變小，胚發(fā)育延遲，糊粉層細胞變小，結(jié)實率降低[36]。OsFIE2和OsCLF互作，OsFIE2介導(dǎo)的OsFIE2-PcG聚梳蛋白復(fù)合體調(diào)控水稻種子發(fā)育和灌漿[37-38]。

2.4 蛋白泛素化降解調(diào)控種子發(fā)育

泛素化是介導(dǎo)植物蛋白降解的重要途徑，需要3種泛素酶的協(xié)同作用。泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2激活泛素和泛素連接酶E3形成三聚體，特異性識別靶蛋白并標記泛素，被標記的靶蛋白由蛋白酶體識別降解，泛素化途徑參與調(diào)控種子大小[39-42,59]。泛素受體、E3泛素連接酶、泛素特異蛋白酶、26S蛋白酶體、植物特異性APC/C調(diào)節(jié)因子及泛素化途徑互作蛋白等，均在調(diào)節(jié)種子大小和發(fā)育中起著重要作用。

泛素受體DA1編碼一個含有2個泛素互作基序UIM和1個LIM結(jié)構(gòu)域的蛋白，具有泛素結(jié)合酶活性，綁定多聚泛素蛋白后,通過26S蛋白酶體調(diào)節(jié)其降解。da1-1突變體種子變大，重量增加[39-40]。DA1的同源基因DAR是植物中特有的基因，也參與組織和種子大小調(diào)控[40]。環(huán)型蛋白E3 泛素連接酶是雙子葉和單子葉植物中調(diào)控種子大小的主要因子，通過調(diào)控細胞分化和擴增影響種子發(fā)育。E3泛素連接酶BB/EOD1，DA2在擬南芥中負調(diào)控種子大小，過表達BB/EOD1、DA2種子變?。凰局羞^表達DA2同源基因GRAINWIDTHANDWEIGHT2，種子也顯著變小[39,41]。GW2是一個具有 E3 泛素連接酶活性，且由數(shù)量性狀位點(QTL)基因編碼的環(huán)型蛋白，該基因突變后谷粒變寬，種子變大[42]。GW5是水稻中的另一個主效QTL位點，可能和GW2互作參與泛素化調(diào)控途徑，調(diào)節(jié)種子發(fā)育過程中的細胞分化，影響種子大小[43]。

26S蛋白酶體是降解泛素標記蛋白的主要蛋白酶，具有多個多亞基，其調(diào)節(jié)亞基RPT2a的基因功能缺失會導(dǎo)致26S 蛋白酶體活性下降，種子變大[44]。細胞周期蛋白調(diào)節(jié)細胞分化和細胞增殖，E3 泛素連接酶復(fù)合物APC/C能識別細胞周期蛋白，調(diào)控細胞分裂周期調(diào)控，介導(dǎo)細胞周期蛋白降解。SAMBA是植物中特有的APC/C調(diào)節(jié)子，負調(diào)控種子大小，在胚形成時期大量表達。該基因突變后A2型細胞周期蛋白CYCA2;3穩(wěn)定性增強，啟動細胞增殖和核內(nèi)復(fù)制，種子增大[45]。

3 展望

植物種子是裸子植物和被子植物特有的繁殖器官，植物種子中的淀粉、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)不僅為下一代的萌發(fā)和發(fā)育提供養(yǎng)分，也為人類提供主要糧食來源。種子的發(fā)育狀態(tài)影響其后代的生長發(fā)育，也影響農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量。因此，研究植物種子的發(fā)育及調(diào)控不僅對研究植物發(fā)育，同時對作物高產(chǎn)育種具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

植物種子發(fā)育是一個極其精細復(fù)雜的過程，在植物種子的發(fā)育過程中，不僅有大量基因直接參與調(diào)控種子胚和胚乳的發(fā)育，還有線粒體復(fù)合體上基因的突變、參與線粒體RNA加工的PPR蛋白、植物激素、泛素化相關(guān)蛋白，DNA甲基化、組蛋白甲基化、siRNA，miRNA[60]和非編碼長鏈RNA等都會影響植物種子胚和胚乳的發(fā)育。除此之外，還有大量轉(zhuǎn)錄因子通過組成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這些轉(zhuǎn)錄因子分別在種子發(fā)育的不同時期通過結(jié)構(gòu)域與順式元件相互作用調(diào)控相應(yīng)基因的表達，如MADS、B3、bHLH、bZIP、C3H、ERF、NAC、MYB、WRKY等家族的轉(zhuǎn)錄因子，在植株種子發(fā)育過程中起到了極其重要的調(diào)控作用[46]。目前還鑒定到了一些谷蛋白轉(zhuǎn)運關(guān)鍵因子[61]和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫應(yīng)答相關(guān)的蛋白[62]，這些基因突變后，導(dǎo)致種子中淀粉的積累和谷蛋白含量發(fā)生改變，從而影響種子形態(tài)、大小。此外，細胞周期蛋白[63]，與DNA損傷修復(fù)[64]、養(yǎng)分傳遞等相關(guān)的蛋白[65]、溫度等相關(guān)因素，也會影響種子的發(fā)育。

隨著分子生物學研究方法和技術(shù)手段的不斷發(fā)展，植物種子發(fā)育的分子機制尤其是針對種子大小、數(shù)量、品質(zhì)等發(fā)育相關(guān)的研究取得了很大進展。但是，這些調(diào)控基因之間的互作、不同調(diào)控途徑之間的交互作用、更多相關(guān)基因的發(fā)掘還需要進一步研究。明確不同的調(diào)控因子在種子發(fā)育中的作用，并通過全基因組關(guān)聯(lián)分析選擇人類需要的等位突變將有助于提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)，為人類糧食供給做更大貢獻。