鄭在超，李 鈁，楊 豐

(自然資源部第三海洋研究所、海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門 361005)

在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究中，細(xì)胞數(shù)量是一個常用的生理指標(biāo)。例如，在人類疾病研究中，血細(xì)胞數(shù)量被用作貧血和炎癥的指標(biāo)[1]，血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞數(shù)目[2]和浸潤在組織中的腫瘤細(xì)胞數(shù)目[3]被作為癌癥檢測的重要指標(biāo)。在微生物研究中，藻類[4]和細(xì)菌[5]的數(shù)量被作為環(huán)境監(jiān)測指標(biāo)。而在水產(chǎn)動物的研究中，循環(huán)血細(xì)胞數(shù)量是評估甲殼動物[6]、軟體動物[7]、魚類[8]等的免疫狀態(tài)的指標(biāo)。

細(xì)胞計數(shù)的常見方法有直接法和間接法。直接法即直接對細(xì)胞群進(jìn)行計數(shù)，例如，血球計數(shù)板法是將細(xì)胞懸液滴在劃有方格的玻璃上通過鏡檢計數(shù)[9]；連續(xù)稀釋法是將菌液稀釋涂布后對單菌落進(jìn)行計數(shù)[10]；電子細(xì)胞計數(shù)儀是基于庫爾特計數(shù)原理，在細(xì)胞通過充滿電解質(zhì)的測定管后，根據(jù)電阻的變化計算細(xì)胞直徑，最后統(tǒng)計出給定大小的細(xì)胞數(shù)目[11]；流式細(xì)胞儀可以將單個細(xì)胞一一分開分別測定熒光值等指標(biāo)并進(jìn)行計數(shù)[12]。間接法中，可以根據(jù)菌液濁度估算細(xì)胞數(shù)量[9]；MTT法利用3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]被活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶氧化為藍(lán)色的甲臜，再加入二甲基亞砜(DMSO)溶解并測定其光吸收值來估算活細(xì)胞數(shù)量[13]。雖然細(xì)胞計數(shù)的方法種類繁多，但是上述方法均不適合用于直接測定實體組織的細(xì)胞數(shù)。對于實體組織而言，通常需要利用膠原酶[14]、胰蛋白酶[15]，或纖維素酶[16]等將塊狀組織消化為單細(xì)胞懸液再進(jìn)行計數(shù)，而這個方法也并不適用于所有實體組織，且操作繁瑣，組織消化的充分程度直接影響準(zhǔn)確性。

實時熒光定量PCR(Real-Time Fluorescence Quantitative PCR， qPCR)可用于定量分析特定基因的拷貝數(shù)[17]，因此，這一方法被廣泛用于病毒[18]、細(xì)菌[19]等微生物數(shù)量的測定。雖然這個方法較少用于動植物細(xì)胞計數(shù)，但確有學(xué)者通過qPCR檢測特定基因來評估血液和組織中某些特殊的細(xì)胞的含量[20]。

在對螯蝦、對蝦、蟹類等養(yǎng)殖甲殼動物的研究中，研究者多以實體組織的整體為單位來評價病原的感染增殖或分析宿主和病原基因的表達(dá)。實際上不同組織的細(xì)胞含量存在較大差異，因此，在進(jìn)行組織間比較時，整體組織水平的檢測無法完全反映單細(xì)胞水平的情況。此外，病原感染、外傷等外界刺激也有可能引起實體組織中細(xì)胞數(shù)量的改變，目前尚未有合適的方法對此進(jìn)行定量分析。

本研究建立了基于基因拷貝數(shù)的紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)細(xì)胞數(shù)量測定方法。該方法以beta-actin基因為目標(biāo)基因，以已知數(shù)量的血細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)樣，通過qPCR測定實體組織的細(xì)胞數(shù)量，具有方便快捷和高通量的優(yōu)點。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

紅螯螯蝦購自汕頭紀(jì)雄水產(chǎn)有限公司，飼養(yǎng)于25 ℃左右環(huán)境中，隔天喂食換水，實驗前暫養(yǎng)一個月左右，檢測未見蝦類常見病原。

1.2 基因克隆和測序

根據(jù)beta-actin(GenBank登錄號: MN396754.1)和GAPDH(GenBank登錄號: KM538172.1)兩個基因的mRNA序列設(shè)計引物(表1)。使用天根生化科技(北京)有限公司的海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取螯蝦鰓組織DNA。使用Takara公司的PrimeSTAR HS試劑盒進(jìn)行PCR。PCR程序設(shè)置為98 ℃變性15 s，55 ℃/58 ℃(GAPDH/beta-actin)退火5 s，72 ℃延伸120 s，共25個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，明亮的條帶切膠回收后委托鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。

1.3 qPCR引物設(shè)計

根據(jù)所獲得的兩個基因的DNA序列，設(shè)計qPCR引物(表1)，使一對引物中的一條位于內(nèi)含子區(qū)，一條位于外顯子區(qū)。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.4 樣品制備

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品制備 取3只紅螯螯蝦，分別抽取約2 mL血淋巴；用Orfol公司的Moxi Z細(xì)胞計數(shù)儀測定血細(xì)胞數(shù)目。從每一份樣品中取5×106個血細(xì)胞，按“1.2”所述方法提取基因組DNA。然后取相當(dāng)于1×105、1×104、1×103、1×102、1×10個血細(xì)胞的DNA樣品作為qPCR的標(biāo)準(zhǔn)模板，共有來源于3只不同螯蝦的3組樣品。

1.4.2 待測樣品制備 取10 mg鰓或肝胰腺組織，按“1.2”所述方法提取基因組DNA，產(chǎn)物用100 μL無菌水溶解，取2 μL (相當(dāng)于0.2 mg組織的DNA)作為qPCR模板。

1.5 qPCR(染料法)

使用TOYOBO的SYBR? Green Realtime PCR Master Mix試劑盒和Applied Biosystems StepOneTMqPCR儀。反應(yīng)體系中含DNA模板2 μL，正反向引物(10 μmol/L) 各1 μL，去離子水6 μL，PCR預(yù)混液10 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)。

1.6 擴(kuò)增效率分析

取3只紅螯螯蝦，按“1.4”所述方法分別制備血細(xì)胞、鰓和肝胰腺組織的基因組DNA樣品。取相當(dāng)于1×105個血細(xì)胞，或者相當(dāng)于0.2 mg鰓和肝胰腺組織的基因組DNA。每個樣品制備成：原濃度、10倍稀釋、100倍稀釋、1 000倍稀釋共4個梯度。對上述樣品進(jìn)行beta-actin基因的qPCR檢測，獲得Ct值，并計算擴(kuò)增效率和擬合優(yōu)度(R2)。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因克隆

通常來說，基因組拷貝數(shù)在同一物種不同組織的體細(xì)胞中是相同的，處于有絲分裂S、 G2、 M期、染色體倍性異常的細(xì)胞，以及多核細(xì)胞等特殊情況除外。因此，通常同等數(shù)量的不同組織細(xì)胞，其某個基因的拷貝數(shù)是一致的，可以通過對基因的定量來測算細(xì)胞數(shù)。我們選擇了GAPDH、beta-actin這兩個常見的看家基因作為目標(biāo)基因，根據(jù)其mRNA序列設(shè)計了引物(表1)。用紅螯螯蝦鰓組織的基因組DNA作為模板分別擴(kuò)增這兩個基因的DNA序列，均得到了清晰明亮的單一條帶。GAPDH的PCR產(chǎn)物長度約為2 000 bp，beta-actin的PCR產(chǎn)物長度在1 000～2 000 bp之間(圖1)。測序結(jié)果表明GAPDH基因片段長度為2 066 bp (GenBank登錄號: MN918114.1)，beta-actin基因片段長度為1 641 bp(GenBank登錄號: MN918115.1)，與瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果相符。我們將兩個基因片段與對應(yīng)的mRNA序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)兩種基因的序列中各含一個內(nèi)含子，其中GAPDH的內(nèi)含子長654 bp，beta-actin的內(nèi)含子長191 bp。

圖1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis analysis of PCR productsM：分子量標(biāo)準(zhǔn)； a： beta-actin； b： GAPDH。

2.2 qPCR的引物設(shè)計和熔解曲線分析

根據(jù)獲得的GAPDH和beta-actin基因片段設(shè)計qPCR引物(表1)，其中一條設(shè)計在外顯子區(qū)，另一條設(shè)計在內(nèi)含子區(qū)，使其僅能以基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。其中GAPDH的qPCR產(chǎn)物長100 bp，beta-actin的qPCR產(chǎn)物長56 bp。進(jìn)一步以多個血細(xì)胞和鰓組織的基因組DNA樣本為模板，對兩個基因qPCR的熔解曲線進(jìn)行檢測，結(jié)果表明GAPDH的熔解曲線存在雜峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物不均一；而beta-actin的熔解曲線呈現(xiàn)出單峰，沒有非特異性擴(kuò)增，效果較好(圖2)。因此我們選用beta-actin作為qPCR的目標(biāo)基因。

2.3 beta-actin基因在不同組織中的擴(kuò)增效率分析

血細(xì)胞是均勻分散的單個細(xì)胞，可以采用細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行準(zhǔn)確的計數(shù)。成熟血細(xì)胞不具有分裂能力[21]，基因組DNA不復(fù)制，因此其目標(biāo)基因的含量可以直接與細(xì)胞數(shù)量對應(yīng)。所以，本研究選擇血細(xì)胞作為細(xì)胞計數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品；以血細(xì)胞數(shù)目為基準(zhǔn)，用qPCR相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法測算實體組織的細(xì)胞數(shù)目。在qPCR中，擴(kuò)增效率對于實驗的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。因此，我們以梯度稀釋的鰓、肝胰腺和血細(xì)胞的基因組DNA為模板，測算了beta-actin基因的qPCR擴(kuò)增效率。結(jié)果顯示，以3種組織的基因組DNA為模板，beta-actin基因的擴(kuò)增效率均達(dá)到qPCR要求的90%～110%范圍[22]，擴(kuò)增效率基本一致(表2)。因此，利用血細(xì)胞樣品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠用于測算其他組織的細(xì)胞含量。

2.4 利用qPCR進(jìn)行實體組織細(xì)胞計數(shù)

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取3只紅螯螯蝦，分別抽取約2 mL血淋巴，用細(xì)胞計數(shù)儀測定血細(xì)胞數(shù)目，提取基因組DNA。取相當(dāng)于1×105、1×104、1×103、1×102、1×10個血細(xì)胞的DNA樣品作為標(biāo)準(zhǔn)模板，進(jìn)行beta-actin基因的qPCR分析。以血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品的細(xì)胞數(shù)對數(shù)值和所對應(yīng)的Ct值作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，不同批次樣品之間的重復(fù)性良好；在測試范圍內(nèi)(1×10～1×105個細(xì)胞)，qPCR的Ct值與細(xì)胞數(shù)的對數(shù)之間呈良好的線性關(guān)系，線性回歸得到回歸曲線(圖3)和回歸方程Ct=38.30-3.37 lg (N)，其中，N是細(xì)胞數(shù)量。此外，測得R2=0.992，擴(kuò)增效率為97.74%。

圖2 qPCR熔解曲線Fig. 2 qPCR melt curves縱坐標(biāo)中F為熒光強(qiáng)度，T為溫度。

表2 不同組織樣品的qPCR擴(kuò)增效率分析Tab. 2 qPCR amplification efficiency analysis with different tissue samples

圖3 qPCR組織細(xì)胞計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 qPCR standard curve of cell counting

2.4.2 實體組織的細(xì)胞計數(shù) 取3只螯蝦，分別取10 mg鰓組織和肝胰腺組織，提取基因組DNA。隨后每個樣品取相當(dāng)于0.2 mg 組織的DNA作為模板進(jìn)行beta-actin基因的qPCR分析。測得0.2 mg鰓組織樣品對應(yīng)的Ct值為22.65～22.96，根據(jù)上述公式計算可得細(xì)胞數(shù)為3.6×104～4.4×104；0.2 mg肝胰腺組織的Ct值為21.21～21.29，計算可得細(xì)胞數(shù)為1.1×105～1.2×105。所以鰓組織中平均細(xì)胞含量約為2.0×105個細(xì)胞/mg，肝胰腺組織中平均細(xì)胞含量約為5.8×105個細(xì)胞/mg，說明不同組織的細(xì)胞含量存在明顯差異，相同質(zhì)量的鰓組織中的細(xì)胞數(shù)目較少，而肝胰腺組織的細(xì)胞數(shù)較多。而同一組織不同樣本之間的差異較少，鰓組織在1.8×105～2.2×105個細(xì)胞/mg之間，肝胰腺組織在5.5×105～6.0×105個細(xì)胞/mg之間。上述結(jié)果表明qPCR相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法能夠有效地測算實體組織的細(xì)胞數(shù)目(表3)。

2.5 討論

本研究建立了基于基因拷貝數(shù)和qPCR的實體組織細(xì)胞計數(shù)方法。利用這一方法，首先可以定量分析螯蝦不同組織在細(xì)胞含量上的差異，加深對不同組織結(jié)構(gòu)的認(rèn)識。其次，在對養(yǎng)殖甲殼動物病毒性疾病的研究中，研究者多以實體組織的整體為單位來評價病毒的組織特異性，比較在不同組織中的增殖效率。而病毒是在宿主細(xì)胞中復(fù)制繁殖的，同等質(zhì)量的不同組織細(xì)胞含量存在差異。因此以組織質(zhì)量為單位來衡量病毒在某種細(xì)胞中的增殖情況存在一定的不足。通過對特定組織中的病毒量和細(xì)胞數(shù)的定量分析，可以得出平均每個細(xì)胞的病毒載量，能夠更準(zhǔn)確的了解病毒對不同組織細(xì)胞的嗜性。再次，研究者在分析宿主基因表達(dá)的時候，也往往以表達(dá)量與組織質(zhì)量的比值作為指標(biāo)。通過對目標(biāo)組織進(jìn)行定量，可以使我們對不同組織基因表達(dá)分析的精度提高到細(xì)胞水平，提升了組織間基因表達(dá)橫向比較的維度。此外，研究表明，甲殼動物血細(xì)胞數(shù)量會受到病原感染、蛻殼周期，晝夜節(jié)律等的影響。實體組織中的細(xì)胞含量(特別是像鰓這樣包含了許多血細(xì)胞的實體組織)，是否也有可能會受到上述因素的影響目前尚未可知。本研究所建立的方法為探究這一問題提供了技術(shù)手段。

表3 鰓和肝胰腺組織細(xì)胞計數(shù)結(jié)果Tab. 3 Cell count results of gill and hepatopancreas

利用本研究所建立的方法進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，需要注意以下幾點：①實驗中所取的樣品量直接影響計數(shù)結(jié)果，因此每個組織至少需要取3個平行樣品以減小取樣不均造成的誤差。②不同基因組DNA提取試劑盒的提取效率不同，在實驗過程中盡量選擇同一種試劑盒。此外，在DNA稀釋的過程中需盡量準(zhǔn)確，避免操作誤差。③qPCR過程中，標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)增效率極為重要，首先要保證待測組織和血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增效率相近，才能對待測組織進(jìn)行測算。如果對于細(xì)胞數(shù)目的測定精度要求較高，可以考慮增加參考基因數(shù)目。除了本實驗提供的beta-actin基因，還可設(shè)計2～3對其他基因的跨內(nèi)含子、外顯子引物，使用多個基因進(jìn)行校準(zhǔn)。④由于本方法是基于基因拷貝數(shù)進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，因此對處于有絲分裂期的細(xì)胞的測算會存在一定的偏差。如果組織中處于S和M期的細(xì)胞比例較高，需要根據(jù)比例對細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行一定的校正。此外，多核細(xì)胞無法用本法進(jìn)行計數(shù)。

3 結(jié)論

綜上所述，本研究建立了基于基因拷貝數(shù)和qPCR的螯蝦實體組織細(xì)胞計數(shù)方法。根據(jù)螯蝦成熟血細(xì)胞不能增殖，且其單細(xì)胞懸液可以準(zhǔn)確計數(shù)的特點，選取已知數(shù)量的血細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)樣。通過熔解曲線分析，選擇了beta-actin基因作為目標(biāo)基因。利用血細(xì)胞基因組DNA為標(biāo)準(zhǔn)模板，進(jìn)行beta-actin基因的qPCR分析；基于細(xì)胞數(shù)和Ct值繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出了細(xì)胞數(shù)量與Ct值的換算公式。并利用相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法成功測定了鰓組織和肝胰腺組織的細(xì)胞數(shù)目。該方法具有簡單便捷的優(yōu)點，可以實現(xiàn)對實體組織細(xì)胞數(shù)量的高通量測定。