王希濤 郝 林 周祥舉 周榮升 周家合賀厚光 張軒銘 王 建 夏 天 韓從輝**

1.徐州市中心醫(yī)院泌尿外科（江蘇徐州 221009）；2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院（江蘇南京 210009）

良性前列腺增生癥 （benign prostatic hyperplasia，BPH）在泌尿男科中發(fā)病率較高，是男性最常見的泌尿生殖系統(tǒng)疾病之一[1]。 它被認(rèn)為是前列腺間質(zhì)和上皮細(xì)胞的非惡性不受控增生， 以進(jìn)行性腺體和間質(zhì)組織增生為特征，導(dǎo)致前列腺增大[2]。 前列腺增生的患者常有下尿路癥狀，如尿頻、尿急、排空感不完全、夜尿癥等都可能與BPH有關(guān)，并發(fā)癥包括急性尿潴留、尿路梗阻和尿路感染等[3]。

BPH 的病理生理學(xué)機(jī)制較復(fù)雜， 目前尚未完全明確，但是，衰老及雄激素水平的變化可能是BPH 發(fā)病的機(jī)制[4]。 前列腺組織的發(fā)育、生長(zhǎng)和增殖依賴于雄激素受體激動(dòng)劑，即雙氫睪酮（DHT）的刺激，雙氫睪酮是由前列腺內(nèi)循環(huán)的睪酮合成的， 當(dāng)睪酮水平減少或DHT激素水平過(guò)高時(shí)，可能會(huì)引起前列腺增生[5]。 同時(shí)，許多研究表明， 血管生成以及細(xì)胞增殖或凋亡紊亂與BPH的發(fā)生密切相關(guān)，可能是導(dǎo)致BPH 的重要機(jī)制[6]。 有研究顯示血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在BPH 患者前列腺組織中高表達(dá)[7]。 TGF-β1 是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的一種，也有研究表明前列腺增生組織TGF-β1 水平升高[8]。

目前，BPH 的治療藥物多為單一作用靶點(diǎn)，比如只針對(duì)降低體內(nèi)活性睪酮， 抑制雄激素， 抑制血管形成等，但治療效果并不理想。 因此，迫切需要一種針對(duì)該病作用靶點(diǎn)多、不良反應(yīng)少的藥物用于BPH 的長(zhǎng)期維持治療。 天然藥物，尤其是中醫(yī)藥，已被廣泛用于臨床許多疾病的治療。 近年來(lái)， 中醫(yī)藥以其獨(dú)特的療效在BPH 的藥物治療中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用[9-11]。 中醫(yī)根據(jù)BPH 在其臨床表現(xiàn)，將其歸屬于中醫(yī)“癃閉”范疇，而“癃閉”的證治分類包括濁淤阻塞證，其證機(jī)概要為淤血敗精，阻塞尿道，水道不通[12-13]。 桂枝茯苓膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字Z10950005）處方來(lái)源于張仲景《金匱要略》所載之桂枝茯苓丸，屬古典經(jīng)方。 桂枝茯苓膠囊由桂枝、茯苓、丹皮、桃仁、芍藥等藥物組成，具有活血，化瘀，消癥之功效[14]。因此，桂枝茯苓膠囊治療BPH 也符合中醫(yī)的辨證論治原則。孫一鳴等[15]用桂枝茯苓丸加味湯劑聯(lián)合穴位注射治療BPH 50 例，發(fā)現(xiàn)其能有效提高療效。 劉春宇等[16]研究表明不同劑量的桂枝茯苓膠囊可以抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠的前列腺增生，減少前列腺腔擴(kuò)張。 周一飛等[17]進(jìn)行的多中心臨床研究表明桂枝茯苓膠囊治療前列腺增生癥（淤阻膀胱癥）臨床療效確切，總有效率達(dá)到84.2%。 但是，目前缺少對(duì)桂枝茯苓膠囊治療前列腺增生的相關(guān)機(jī)制研究。

本研究通過(guò)建立去勢(shì)后睪酮誘導(dǎo)的前列腺增生大鼠模型，使用桂枝茯苓膠囊進(jìn)行干預(yù)，Elisa 檢測(cè)前列腺增生大鼠血清和前列腺組織中的DHT，通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)前列腺組織中VEGF 及TGF-β1 的表達(dá)水平， 觀察桂枝茯苓膠囊對(duì)前列腺增生模型大鼠體內(nèi)VEGF 及TGF-β1 表達(dá)的影響，并探討其作用機(jī)制，為臨床BPH 的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康性成熟雄性SD 大鼠50 只，體重約200～250g，無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF 級(jí)），飼養(yǎng)過(guò)程，保證室內(nèi)溫度20 ℃～26 ℃，濕度40%～60%，光照12 h/d，自由攝食、飲水，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境7d 后開始實(shí)驗(yàn)。

二、主要藥物及試劑

桂枝茯苓膠囊（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10950005）； 非那雄胺 （BBI 生命科學(xué)有限公司，A606226-0025）；羧甲基纖維素鈉（生工生物工程(上海)股份有限公司，A501427-250g）；橄欖油（生工生物工程(上海)股份有限公司，A502795-0100）；丙酸睪丸素（阿拉丁試劑(上海)有限公司，T101368-25g）；睪酮ELISA Kit（abcam 公司，ab108666）大鼠DHT ELISA Kit（上海通蔚生物有限公司，TWp002998）；大鼠ALT ELISA Kit（上海通蔚生物有限公司，tw037122）；大鼠ASTELISA Kit（上海通蔚生物有限公司，tw037120）；TGF-β1 一抗（abcam 公司，ab92486）；VEGF 一抗（proteintech 公司，19003-1-AP）。

三、主要儀器和設(shè)備

冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；Power PacTMHC 電泳儀 （Bio-Rad）；VE-180 垂直電泳槽（上海天能）；DY-B1 脫色搖床（上海滬西儀器）；Tanon 4200 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能）；中性樹膠封片劑（生工）；石蠟組織切片機(jī)（徠卡）；生物組織攤烤片機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；光學(xué)顯微鏡（佳能）；ABI stepone plus 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(LIfe)。

四、實(shí)驗(yàn)分組

將雄性SD 大鼠隨機(jī)分為5 組，每組10 只?？瞻捉M(假手術(shù)組)， 模型組， 桂枝茯苓膠囊高劑量組[0.5 g/(kg·d)]，桂枝茯苓膠囊低劑量組[0.25 g/(kg·d)]，非那雄胺組[1mg/(kg·d)]。

五、造模及給藥方法

前列腺增生大鼠模型參考文獻(xiàn)造模方法[18]，造模大鼠經(jīng)腹腔注射4%水合氯醛溶液(3.5 ml/kg)進(jìn)行全身麻醉，無(wú)菌條件下切除雙側(cè)睪丸，空白組大鼠行假手術(shù)。 經(jīng)1 周自然恢復(fù)后，造模大鼠皮下注射丙酸睪酮0.5 mg/(kg·d)（溶于0.1 ml 芝麻油）造模，空白組大鼠皮下注射等體積芝麻油， 連續(xù)注射28 d 后， 麻醉下進(jìn)行前列腺活組織檢查，以確認(rèn)造模成功。 組織檢查達(dá)到前列腺增生標(biāo)準(zhǔn)（即前列腺上皮增生， 形成密集的皺褶或乳頭狀結(jié)構(gòu)充滿腺腔，管壁增厚；部分腺體周圍間質(zhì)細(xì)胞及纖維組織增生）則造模成功。

28 d 造模成功后， 空白組及模型組給予羧甲基纖維素溶液灌胃治療，各治療組予相應(yīng)藥物溶于羧甲基纖維素溶液，然后連續(xù)灌胃28d，大鼠每次灌胃量10ml/(kg·d)。

六、標(biāo)本采集

各組大鼠于末次給藥后，稱取大鼠體重并記錄，留靜脈血， 麻醉下完整切除雙側(cè)前列腺組織并于冰冷的生理鹽水中漂洗，仔細(xì)剝離，去除血液、脂肪等組織，稱取前列腺重量并記錄，使用4%多聚甲醛溶液固定。

七、Elisa 檢測(cè)

從已平衡至室溫的密封袋中取出實(shí)驗(yàn)所需板條，加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，加入氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體，封住反應(yīng)孔，37℃溫箱孵育60 分鐘，清洗后打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好程序。 加入顯色底物A、B，加入終止液50ul/孔， 混勻后即刻測(cè)量OD450 （3 分鐘內(nèi)）。 在儀器保存血清和前列腺組織的DHT 讀數(shù)結(jié)果。

八、實(shí)時(shí)定量PCR

首先提取RNA， 將細(xì)胞用預(yù)冷PBS 緩沖液洗2遍，加1ml Ezol 裂解液重懸。加入0.2ml 三氯甲烷，劇烈搖動(dòng)10s，室溫放置3 分鐘。 4℃，12,000×g 離心20min。將上清水相轉(zhuǎn)移至另一新的無(wú)RNA 酶離心管中，并加入等體積的100%乙醇。 吸取全部樣品， 加入帶有2ml收集管的mini-spin 離心柱。 8,000×g，室溫離心15 s，棄盡流穿液。 將剩余的樣品轉(zhuǎn)移至離心柱，重復(fù)第6 步。往離心柱中加入700μl WB，輕蓋蓋子，8,000×g，室溫離心15 s，棄盡流穿液。 重復(fù)第8 步，用500μl WB 洗滌離心柱三次。 將離心柱轉(zhuǎn)移至一新的無(wú)RNA 酶的1.5ml 離心管中， 往硅膠膜中央滴加50μl DEPC 水，4℃，10,000×g 離心3min 洗脫RNA。 并通過(guò)mRNA 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、mRNA 實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系、 定量PCR 反應(yīng)程序， 最終定量測(cè)定前列腺組織的VEGF 和TGF-β1 含量。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所得到的計(jì)量資料用±s 表示， 經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)后，方差齊者組間總體的比較采用One-way ANOVA，方差不齊采用秩和檢驗(yàn)； 有差異者進(jìn)一步采用LSD-t 進(jìn)行兩兩比較， 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05， 血清和前列腺組織的DHT 以及前列腺組織中VEGF 和TGF-β1 實(shí)施定量PCR 測(cè)定，采用GraphPad Prism 8 繪制柱狀圖。

結(jié) 果

一、各組大鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)改變情況

一共50 只SD 大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 構(gòu)建SD 大鼠BPH模型40 只，每組10 只，空白組10 只作為對(duì)照，按照公式（前列腺指數(shù)=前列腺濕重/體重）計(jì)算大鼠前列腺指數(shù)。 各組前列腺增生模型大鼠前列腺濕重、體重及前列腺指數(shù)見表1。與空白組相比，模型組的前列腺濕重明顯增加(P＜0.01)；而桂枝茯苓治療組及非那雄胺組的前列腺濕重較模型組則明顯降低(P＜0.01)；桂枝茯苓高劑量組較桂枝茯苓低劑量組的前列腺濕重降低更明顯(P＜0.01)。

表1 各組大鼠前列腺濕重、大鼠體重和前列腺指數(shù)

二、各組前列腺組織病理切片

顯微鏡（40 倍） 下正常組前列腺腺體排列規(guī)整有序，腺腔無(wú)擴(kuò)張，腺上皮無(wú)任何增厚，呈單層柱狀，腺體間可見間質(zhì)。 BPH 模型組腺體排列較亂,腺上皮厚度增加， 上皮細(xì)胞數(shù)量變多， 腺上皮形成乳頭狀突入腺腔內(nèi)，腺腔內(nèi)可見分泌物，內(nèi)部空間縮小。 非那雄胺組和桂枝茯苓膠囊組腺腔擴(kuò)張較少， 腺上皮細(xì)胞數(shù)目明顯少于模型組，且低柱狀上皮多見，腺腔直徑與腺上皮高度同模型組相比，差異非常顯著。 結(jié)果見圖1。

三、各組ELisa 檢測(cè)血清和前列腺組織DHT 含量

與空白組對(duì)比， 前列腺增生模型組血清DHT 含量明顯升高（16.84±1.13）mg/ml vs（4.68±0.63）mg/ml，P＜0.01；與前列腺增生模型組對(duì)比，非那雄胺組、桂枝茯苓膠囊低劑量和高劑量組血清DHT 均下降， 且P均＜0.01， 三組血清DHT 含量分別是 （9.14±1.03）mg/ml、（12.58±0.83）mg/ml、（10.52±1.32）mg/ml， 說(shuō)明桂枝茯苓膠囊可以降低大鼠血清中的DHT 含量。 與空白組對(duì)比，前列腺增生模型組前列腺組織DHT 含量明顯 升高（193.96±9.97）ng/mg vs（56.20±3.76）ng/mg，P＜0.01；與前列腺增生模型組對(duì)比，非那雄胺組、桂枝茯苓膠囊低劑量和高劑量組前列腺組織DHT 均下降，且P 均＜0.01，三組前列腺組織DHT 含量分別是（88.72±7.34）ng/mg、 （154.08±10.42）ng/mg、 （121.80±7.73）ng/mg，而且桂枝茯苓高劑量組前列腺組織DHT含量比低劑量組更低，說(shuō)明桂枝茯苓膠囊可以降低大鼠前列腺組織中的DHT 含量， 且高劑量組降低效果更佳。

四、 各組qRT-PCR 檢測(cè)前列腺組織中VEGF 和TGF-β1 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量

與空白組對(duì)比，前列腺增生組前列腺組織VEGF 相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，非那雄胺、桂枝茯苓膠囊低劑量組和高劑量組VEGF 降低（P＜0.05）。BPH 組前列腺組織TGF-β1 mRNA 表達(dá)量與空白組對(duì)比，表達(dá)量升高（P＜0.05）；與BPH 組比較，非那雄胺， 桂枝茯苓膠囊低劑量組和高劑量組TGF-β1 均減少（P＜0.05）。

圖1 各組前列腺組織病理切片圖（HE 染色：×40）

圖2 各組血清和前列腺組織DHT 含量

圖3 各組大鼠前列腺組織中VEGF 和TGF-β1 表達(dá)情況

討 論

BPH 目前主要發(fā)病學(xué)說(shuō)包括雙氫睪酮、 間質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化、雌/雄激素紊亂、胚胎再喚醒、細(xì)胞增殖/凋亡紊亂[19-20]。中醫(yī)認(rèn)為其病機(jī)是腎虛血瘀。腎氣不足，瘀濁結(jié)滯，留滯正焦，膀胱氣化不利，濁癖搏結(jié)，有形之邪，結(jié)而成瘤，凝結(jié)成塊，阻于下焦，導(dǎo)致局部增生，尿道不暢，排尿困難[21]。 趙軍輝認(rèn)為[22]，BPH 與婦科癥瘕有相似的病機(jī)，桂枝茯苓顆泣具有補(bǔ)腎氣、除瘀血、通調(diào)水道之功效，可明顯緩解BPH 患者的臨床癥狀，縮小腺體體積。

本實(shí)驗(yàn)將去睪丸大鼠以丙酸睪丸素成功地造成前列腺增生動(dòng)物模型。 睪丸去勢(shì)可以降低內(nèi)源性睪酮對(duì)本研究的影響。 模型大鼠給予桂枝茯苓膠囊治療28 d后，與模型組相比，明顯減輕前列腺質(zhì)量，減小前列腺體積。 病理結(jié)果表明桂枝茯苓膠囊組與模型組相比，腺腔組織擴(kuò)張較輕，增生腺上皮細(xì)胞數(shù)目也較少，腺上皮高度降低，差異較顯著。 同時(shí)，本研究結(jié)果顯示桂枝茯苓膠囊可降低模型大鼠的前列腺濕重及前列腺指數(shù)，證實(shí)了桂枝茯苓膠囊對(duì)前列腺增生大鼠有治療作用。

DHT 水平升高是較為明確的影響前列腺增生發(fā)生發(fā)展的因素，本研究桂枝茯苓膠囊低劑量組和高劑量組均降低了血清和前列腺組織中的DHT 含量， 說(shuō)明通過(guò)降低DHT 可能是桂枝茯苓膠囊治療前列腺增生的機(jī)制之一。 近年來(lái)研究顯示，前列腺疾病與多種生長(zhǎng)因子的異常表達(dá)有關(guān)，VEGF 和TGF-β1 均為前列腺增生時(shí)促進(jìn)前列腺間質(zhì)和上皮細(xì)胞增生的關(guān)鍵因子[23]。其中最強(qiáng)力的促血管生成因子之一，VEGF 在BPH 組織中的表達(dá)明顯比在正常前列腺組織中的表達(dá)增加， 有研究表明BPH 患者常帶有氧化應(yīng)激特征， 其體內(nèi)抗氧化酶SOD等的活力被抑制而MDA 含量顯著增加，使氧化- 抗氧化平衡態(tài)被打破[24]，導(dǎo)致炎癥發(fā)生。 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子表達(dá)水平主要與前列腺炎癥有關(guān)，從而影響前列腺組織的增殖和生長(zhǎng)[25]。 研究表明患者的前列腺基質(zhì)層TGF-β1 明顯升高，也有報(bào)道TGF-β1 通過(guò)Smad 依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起前列腺組織的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[26-27]。 本研究結(jié)果顯示桂枝茯苓膠囊低劑量組和高劑量組均能降低前列腺組織中VEGF 及TGF-β1 的表達(dá)，以達(dá)到治療前列腺增生的目的。桂枝茯苓通過(guò)抑制VEGF 和TGF-β1 的表達(dá)可能是治療BPH 的潛在機(jī)制。

綜上所述，桂枝茯苓膠囊作為一種中醫(yī)復(fù)方制劑，是一種不同于5α- 還原酶抑制劑和α 受體阻滯劑的藥物，根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，驗(yàn)證了桂枝茯苓膠囊在BPH 治療中的療效及可能機(jī)制， 對(duì)臨床使用桂枝茯苓膠囊治療BPH 有一定的價(jià)值和意義。 也證實(shí)桂枝茯苓膠囊可作為BPH 臨床藥物治療的一個(gè)選擇。 但是， 桂枝茯苓膠囊治療BPH 還需更多的研究，驗(yàn)證相關(guān)的其他更深治療機(jī)制。