張永樂 施新萍 任黎剛 陳建和 張聯(lián)珍 陳麗萍

浙江省立同德醫(yī)院基因檢測(cè)中心（浙江杭州 310012）

不孕不育癥已成為嚴(yán)重影響人類健康的世界第三大疾病，據(jù)WHO 統(tǒng)計(jì)，不孕不育發(fā)生率占育齡夫婦的12%～15%，全球有超過8000 萬患者，而男女發(fā)病各占50%左右[1-2]。 精子密度的改變?cè)谀行圆辉胁挥l(fā)生率中占相當(dāng)比率，約45%患者有少精子癥，20%患有無精子癥[3]。 一項(xiàng)連續(xù)五年的研究發(fā)現(xiàn)，健康成年男性精子密度平均值呈逐年下降趨勢(shì)[4]。而誘發(fā)這一因素主要原因與空氣污染、吸煙、壓力、化學(xué)毒物等相關(guān)[5-6]。近年來人們研究發(fā)現(xiàn)，飲食中的一些元素改變也在影響精子的功能，導(dǎo)致男性不孕不育的發(fā)生，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，體外細(xì)胞培養(yǎng)研究結(jié)果表明， 一些營(yíng)養(yǎng)元素在調(diào)節(jié)精子的生成、成熟和受精等方面起著重要的作用，而這些營(yíng)養(yǎng)成份中葉酸缺乏顯得尤為突出[7]。 亞甲基四氫葉酸還原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase ；MTHFR） 是一種重要的調(diào)控酶，參與葉酸代謝，而MTHFR C677T 基因的多態(tài)性直接與葉酸代謝相關(guān)[8]。 本研究以正常生育能力的男性為對(duì)照，觀察少弱精子癥患者M(jìn)THFRC677T 基因的多態(tài)性，分析基因分型分布及基因頻率與少弱精子癥的關(guān)系。

材料與方法

一、研究對(duì)象

收集2016 年3 月～2019 年12 月期間， 在浙江省立同德醫(yī)院不孕不育門診和男科門診就診的少弱精子癥患者128 例為研究對(duì)象視為觀察組， 平均年齡為32歲（23 ～38）。選擇同期正常精子質(zhì)量的男性108 例視為對(duì)照組，年齡在25～40 歲，

二、觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)[9]

至少兩次精液常規(guī)分析確定為少弱精子癥患者（診斷參照WHO 第五版），排除標(biāo)準(zhǔn)：①染色體核型異常；②Y 染色體微缺失；③精索靜脈曲張；④隱睪；⑤生殖泌尿系統(tǒng)病原體感染或手術(shù)； ⑥重金屬或其他環(huán)境污染物暴露者；⑦長(zhǎng)時(shí)間高溫環(huán)境工作者。 平均年齡為32 歲（23～38）。 對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：男方本次精液常規(guī)分析均在正常范圍內(nèi)。

三、研究方法

取受試者靜脈全血2ml 置于EDTA 抗凝管中，送往本院PCR 室， 采用多重實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)進(jìn)行C677T 基因多態(tài)性分析， 試劑盒為武漢友之友生物科技股份有限公司提供。 DNA 提取，裂解：取200μl 調(diào)整好的細(xì)胞溶液置于1.5ml 的無菌離心管中， 加入20μl蛋白酶K 和200ul 細(xì)胞裂解液（cell lysis solution），充分混勻后，56℃水浴10min。核酸沉淀：向裂解后的離心管中加入無水乙醇200μl 充分混勻后全部轉(zhuǎn)入帶濾膜的柱中放入離心半徑為10cm 離心機(jī)中以11180g 轉(zhuǎn)速離心2min,棄廢液。 洗滌：向柱中加入預(yù)配好的DW1 洗液600ul,再次11180g 轉(zhuǎn)速離心2min,棄廢液，再向柱中加入預(yù)配好的DW2 洗液600ul，11180g 轉(zhuǎn)速離心，2min;棄廢液，重復(fù)DW2 洗滌一次；將柱轉(zhuǎn)入潔凈離心管中11180g 轉(zhuǎn)速離心5min,棄離心管；更換另一潔凈離心管將柱置入，開蓋室溫放置5min,使殘余酒精充分揮發(fā)。 核酸洗脫：將柱植入無菌的1.5ml 離心管中，加入50μlGE洗脫液（注意洗脫液加入膜的中間，但禁止移液槍頭接觸膜），室溫放置5min，11180g 轉(zhuǎn)速離心2min，收集總DNA 模板備用， 洗脫后的總DNA 使用紫外分光光度儀進(jìn)行濃度和純度的測(cè)量， 保證濃度和純度達(dá)到PCR檢 測(cè) 要 求， ( 總 DNA 濃 度 ＞20ng/μl； 純 度1.5＜A260/A280＜2.0)，DNA 模板立即進(jìn)行PCR 或-70°冷凍保存， 提取試劑盒為北京天根生物科技有限公司提供。 PCR 擴(kuò)增:擴(kuò)增總體系20μl（反應(yīng)液18μl，模板2μl）， 擴(kuò)增條件為，37℃2min，95℃5min，95℃15S 58℃45S 運(yùn)行40 個(gè)循環(huán)，結(jié)束擴(kuò)增，儀器自動(dòng)分析，根據(jù)不同的熒光報(bào)告曲線判定結(jié)果。

四、觀察指標(biāo)

觀察兩組受檢者M(jìn)THFR C677T 基因多態(tài)性，具體包含純合野生型(CC)，雜合突變型（CT），純合突變型（TT）以及C,T 等位基因的出現(xiàn)頻率。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律檢驗(yàn)對(duì)研究資料的可靠性分析，應(yīng)用SPSS 20.0 軟件對(duì)本研究資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以“%”表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、觀察組和對(duì)照組年齡差異性分析

128 例觀察組年齡分布為23～38 歲，平均年齡為32 歲，108 例對(duì)照組年齡分布為25～40 歲，平均年齡為33.5 歲，兩組年齡比較t=0.876，P＞0.05,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、 研究資料基因多態(tài)性采用Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律分析選擇資料的可靠性

觀察組和對(duì)照組的所有基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律分析， 結(jié)果顯示χ2分別為0.092 和0.027，P＞0.05, 因此所選人群基因型頻率符合遺傳平衡法則，具有恒定性，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見表1。

表1 對(duì)照組和觀察組Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律分析結(jié)果

三、觀察組和對(duì)照組MTHFR C677T 基因型表達(dá)

觀察組中MTHFR C677T 基因表達(dá)為CC 型基因的人比率顯著低于對(duì)照組，而表達(dá)TT 型基因的比率顯著高于對(duì)照組， 兩組比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＜0.05，CT型基因表達(dá)兩組比率相當(dāng)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞0.05.統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表2。

表2 觀察組與對(duì)照組MTHFRC677T 基因型表達(dá)比率（%）

四、觀察組和對(duì)照組MTHFRC677T 基因中C，T 等位基因表達(dá)

觀察組中MTHFR C677T 基因中C，T 等位基因分別為38.67%，61.33%；對(duì)照組中MTHFR C677T 基因中C，T 等位基因分別為55.09%，44.91%，C，T 等位基因表達(dá)兩組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＜0.05，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見表3。

表3 觀察組與對(duì)照組MTHFR C677T 基因中C，T 等位基因表達(dá)頻率比較（%）

討 論

男性不育是復(fù)雜疾病。 近來研究表明，葉酸對(duì)于男性生殖健康起到至關(guān)重要作用[9]，Lambrot 等[10]人研究提示給雄性小鼠長(zhǎng)期使用缺少葉酸的飼料可導(dǎo)致小鼠睪丸精母細(xì)胞減數(shù)分裂啟動(dòng)延遲，Swayne 和Ly[11-12]分別報(bào)道了葉酸缺乏可致小鼠睪丸精子生成減少。 Najafipour 等[13]調(diào)查研究健康男性低葉酸攝入人群呈現(xiàn)精子密度顯著降低。 敲除葉酸代謝相關(guān)基因的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了葉酸是保障精子正常生成的必須物質(zhì)[14]。 葉酸是一種重要的水溶性B 族維生素，它的吸收、代謝常受多種酶調(diào)控，比如：亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)，甲硫氨酸合成酶(MTR) 和甲硫氨酸合成酶還原酶 (MTRR) 是葉酸代謝途徑中的關(guān)鍵限速酶，而MTHFR C677T 和A1298C，MTR A2756G 及MTRR A66G 等單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在常影響這些酶的活性。 研究報(bào)道[15]MTHFR C677T 純合突變型TT 基因可使酶活性下降一半以上，臨床研究資料[16]指出MTHFR C677T 位點(diǎn)多態(tài)性與特發(fā)性男性不育的精液參數(shù)異常密切相關(guān)，進(jìn)而推測(cè)葉酸代謝途徑異常，引起葉酸利用率下降，阻礙了精子的生成、發(fā)育過程，從而導(dǎo)致不育的發(fā)生。

本研究對(duì)少弱精子患者的觀察組與健康男性患者的對(duì)照組進(jìn)行MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)分析，結(jié)果表明，觀察組的TT 基因型和T 等位基因分布頻率顯著高于觀察組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05。 TT基因型的百分比和T 等位基因分布頻率與我省蔡麗偉的報(bào)道一致[17]。 其實(shí)早在2001 年德國(guó)學(xué)者Bezold 等[18]已報(bào)道不育男性TT 型基因比率顯著高于正常對(duì)照人群，提示MTHFR C677T 基因突變是導(dǎo)致男性不育的一因素。 此后研究印度、韓國(guó)、意大利等國(guó)男性也發(fā)現(xiàn)這一結(jié)論[19-20]。 但也有不同的結(jié)論Ravel 等[21]報(bào)道法國(guó)男性不育患者與MTHFR C677T 基因多態(tài)性無明顯關(guān)聯(lián)。提示MTHFR C677T 基因多態(tài)性在不同種族、地域內(nèi)表現(xiàn)也不相同，另一方面，不同地域的飲食習(xí)慣日攝入葉酸的含量不同也可對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成一定的干擾， 飲食中大量攝入葉酸即便MTHFR C677T 基因表現(xiàn)為TT型， 但體內(nèi)葉酸供應(yīng)充足也不會(huì)出現(xiàn)因少弱精子而引起不育癥[15]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸（Hcy）血癥與多種疾病相關(guān)，邵麗佳等和戈一峰等[22-23]人的研究報(bào)告顯示高Hcy 與男性不育相關(guān), 他們認(rèn)為高Hcy 可抑制谷胱甘肽合成，谷胱甘肽為活性氧的清除物質(zhì)，當(dāng)谷胱甘肽減少時(shí)， 精液中活性氧產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，造成精子生成減少、精子DNA 損傷等，最終導(dǎo)致精液質(zhì)量降低； 此外高Hcy 血癥可能引起睪丸中血管過早發(fā)生動(dòng)脈硬化，影響睪丸的血液供應(yīng)，導(dǎo)致生精功能障礙。 而高Hcy 血癥的產(chǎn)生又與MTHFR C677T 基因多態(tài)性相關(guān)，TT 型基因人群更易患高Hcy 血癥。

綜上所述， 無論是因?yàn)楸Ｕ暇诱Ｉ傻谋仨毼镔|(zhì)- 葉酸缺乏， 還是高Hcy 血癥引起的活性氧產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡被破壞或者睪丸血管過早發(fā)生動(dòng)脈硬化，MTHFR C677T 基因多態(tài)性在其中扮演著重要角色。 因此對(duì)少弱精子癥患者早期進(jìn)行MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測(cè)， 評(píng)估患者是否因葉酸缺乏導(dǎo)致精子數(shù)量、質(zhì)量下降都具有重要意義，為合理補(bǔ)充葉酸提供臨床依據(jù)。