朱 宏 楊岳洲 余 敏 彭獻(xiàn)東 陳 穎 湯曉峰 江 峰**

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院（上海 200011）；2. 上海集愛遺傳與不育診療中心（上海 200011）

不育癥定義為有規(guī)律性生活且未采取避孕措施12月以上，未使女方臨床妊娠，大約影響全球8%-12%的育齡夫婦；其中男性不育比例占據(jù)50%，而精子因素約占20%-30%[1]。輔助生殖技術(shù)作為治療不育癥的有效手段已在臨床上廣泛應(yīng)用， 其中體外受精- 胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）是常見技術(shù)之一。 國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)結(jié)合精子形態(tài)與前向運(yùn)動精子比例能更好地預(yù)測IVF-ET 臨床妊娠結(jié)局[2]；僅通過精子形態(tài)預(yù)測IVF-ET 臨床妊娠結(jié)局具有一定局限性[3]。然而， 僅以臨床妊娠結(jié)局作為研究終點(diǎn)是不全面的，IVF 的成功與否應(yīng)以每個移植周期是否獲得活產(chǎn)嬰兒出生來判定[4]。 IVF-ET 活產(chǎn)率（live birth rates,LBR）除了依賴于女方的卵子質(zhì)量及宮內(nèi)環(huán)境， 可能與取卵當(dāng)日參與體外受精的精子狀態(tài)亦有著密切的關(guān)聯(lián)。 因此本研究旨在探究取卵當(dāng)日男方精液參數(shù)與IVF-ET 出生結(jié)局之間的關(guān)系。

資料與方法

一、一般資料

本研究以2013 年1 月至2015 年11 月期間于本院生殖中心進(jìn)行IVF-ET 的1374 對夫婦為研究對象。 女方年齡在21 歲至40 歲范圍內(nèi)，各項基礎(chǔ)指標(biāo)均正常，排除子宮肌瘤、輸卵管積水、輸卵管粘連、多囊卵巢綜合癥、 卵巢功能異常等已知的可能影響女方卵子質(zhì)量及胚胎著床的因素， 僅為輸卵管因素不孕且雙側(cè)基礎(chǔ)卵泡數(shù)超過3 枚。 男方年齡在22 歲至50 歲范圍內(nèi)，體檢未發(fā)現(xiàn)明顯的睪丸、附睪及輸精管發(fā)育異常，無精索靜脈曲張、無泌尿系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)感染性疾病且無遺傳性疾病家族史。 男女雙方均滿足要求方納入研究范圍。

二、精液分析

按照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗室手冊》（第5 版）（簡稱《WHO 5》）中精液質(zhì)量分析的標(biāo)準(zhǔn)[5]，男方禁欲2-7 日，于取卵當(dāng)日通過手淫法采集精液于一次性清潔廣口杯中， 獲得的精液樣本放入37℃孵育箱內(nèi)待精液液化后記錄精液顏色、 粘稠度、 體積和pH 值，后利用計算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（computer-aided sperm analysis,CASA）獲取精子濃度、精子總數(shù)、前向運(yùn)動精子（progressive motility,PR）等數(shù)據(jù)。 同時制備精液涂片，使用Diff-Quik 試劑盒（深圳市博銳德生物科技有限公司）快速染色，于1000 倍油鏡下手工計數(shù)不低于200 條精子，精子形態(tài)分析嚴(yán)格按照《WHO 5》中形態(tài)學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

三、體外受精、胚胎觀察及出生結(jié)局評判

按照本中心的標(biāo)準(zhǔn)，精液液化后300g 梯度離心取上清優(yōu)質(zhì)精子備用， 取卵成功后在2h 內(nèi)進(jìn)行常規(guī)受精，18h 后觀察受精情況，有清晰雙原核（2PN）的為受精卵。 選取多枚優(yōu)質(zhì)受精卵移入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 天并對胚胎進(jìn)行評估， 受精第3 天卵裂球達(dá)4～8 個者為優(yōu)質(zhì)胚胎，可用于胚胎移植術(shù)。 評估激素水平，選取1-2枚優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行胚胎移植， 剩余的胚胎結(jié)合患者意愿冷凍保存。

胚胎移植術(shù)后第14 天檢測血液中人絨毛膜促性腺激素（β-hCG）水平，β-hCG 陽性者于移植后28 天至35 天行陰道B 超檢查，能夠觀察到宮內(nèi)胎囊、胎芽、胎心且原始心管搏動者確定為臨床妊娠。 連續(xù)隨訪至妊娠后第3 月、第6 月、第9 月及胎兒出生，記錄不良孕產(chǎn)史、孕周、胎兒出生情況等資料。

四、分組及統(tǒng)計分析

首先依據(jù)出生結(jié)局，將所有樣本分為三組，分別為活產(chǎn)組、流產(chǎn)組及未著床組（包括生化妊娠），比較各組間一般情況及精液參數(shù)水平。進(jìn)一步根據(jù)PR 比例由高到低分為五組，分別為PR≤25%、25%＜PR≤32%、32%＜PR≤40%、40%＜PR＜50%、PR≥50%，比較各組間活產(chǎn)率、流產(chǎn)率、孕周、出生體重及二胎出生體重。 最后以是否獲得活產(chǎn)作為二分類的結(jié)局變量、精液參數(shù)（包括禁欲時間、精液量、濃度、PR、正常形態(tài)率）作為自變量進(jìn)行二元Logistic 回歸分析，比較各精液參數(shù)對出生結(jié)局的預(yù)測價值。

采用SPSS 20.0 版本軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示，采用方差分析對多組之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較。 當(dāng)P 值＜0.05 時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況比較

按出生結(jié)局分組， 其中活產(chǎn)組795 例、 流產(chǎn)組33例、未著床組546 例，各組間女方年齡、女方BMI、男方年齡、男方BMI 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 出生結(jié)局各組一般情況比較（±S）

表1 出生結(jié)局各組一般情況比較（±S）

妊娠結(jié)局 N（例） 女方年齡（歲） 女方BMI 男方年齡（歲） 男方BMI活產(chǎn)組 795 34.17±4.79 21.71±3.03 34.13±5.45 24.35±3.35流產(chǎn)組 33 34.15±4.06 21.00±2.11 34.21±4.78 25.12±3.92未著床組 546 33.88±4.91 21.71±2.98 33.97±5.66 24.30±3.28

二、出生結(jié)局各組精液參數(shù)的比較

活產(chǎn)組精液量顯著高于未著床組（P＜0.01）。 活產(chǎn)組精子濃度高于未著床組（P＜0.05）。 活產(chǎn)組PR 比例分別顯著高于流產(chǎn)組及未著床組（P＜0.01）。 三組之間禁欲時間、精子正常形態(tài)率均無明顯差異。 具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 出生結(jié)局各組精液參數(shù)比較（±S）

表2 出生結(jié)局各組精液參數(shù)比較（±S）

與活產(chǎn)組比較，*、** 分別代表P＜0.05、P＜0.01

分組 N（例） 禁欲時間（天） 精液量（ml） 濃度（×106/ml） PR（%） 正常形態(tài)率（%）活產(chǎn)組 795 5.45±2.04 2.48±0.48 53.18±9.17 36.80±6.36 3.90±1.08流產(chǎn)組 33 5.85±2.25 2.29±0.64 50.33±12.72 33.24±8.69** 3.92±1.00未著床組 546 5.37±2.21 2.40±0.62** 52.00±9.88* 35.22±6.11** 3.82±1.02?

三、不同精子活力出生結(jié)局的關(guān)系比較

隨著PR 比例增高、活產(chǎn)率顯著增高（P＜0.01）；各組間流產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 相較PR≥50%組，PR≤25%組孕周數(shù)更短（P＜0.05）、PR 在40%以下各組二胎出生體重更低（P＜0.05）；各組間一胎出生體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 精子活力與出生結(jié)局的關(guān)系[N/（N%）、±S]

表3 精子活力與出生結(jié)局的關(guān)系[N/（N%）、±S]

與PR≥50%組比較，* 代表P＜0.05

分組 N（例） 活產(chǎn)數(shù)（率）[ 例（%）] 流產(chǎn)數(shù)（率）[ 例（%）] 孕周數(shù)（周） 出生體重（克） 二胎出生體重（克）PR≥50% 37 28（75.68%） 0（0%） 38.76±1.30 3326.43±423.59 3037.50±442.30 40%＜PR＜50% 253 170（67.19%） 4（1.58%） 37.75±1.94 3100.32±609.10 2538.38±455.78 32%＜PR≤40% 680 387（56.92%） 15（2.21%） 38.13±1.99 3207.64±630.06 2525.18±490.92*25%＜PR≤32% 330 180（54.55%） 10（3.03%） 37.86±2.15 3203.42±615.44 2532.50±471.39*PR≤25% 74 30（40.54%） 4（5.41%） 37.10±2.88* 3048.17±559.92 2427.27±605.03*列聯(lián)系數(shù)=0.133P＜0.01 列聯(lián)系數(shù)=0.06P=0.272?

四、精液參數(shù)對出生結(jié)局影響的二元Logistic 回歸分析

PR 比例是各項精液中影響能否獲得活產(chǎn)嬰兒的獨(dú)立危險因素（P＜0.01），優(yōu)勢比（odds ratio,OR）為1.037，95%置信區(qū)間（confidence interval, CI）為1.018-1.056。具體數(shù)據(jù)見表4。

表4 精液參數(shù)影響出生結(jié)局的二元Logistic 回歸分析表

討 論

伴隨人類生活節(jié)奏的加快、 生存環(huán)境的改變以及生活方式的變化， 生育力低下逐漸成為不容忽視的社會問題，尤其是現(xiàn)代男性精液質(zhì)量呈顯著下降趨勢，主要表現(xiàn)為精子濃度、活力、能動性和正常形態(tài)的下降[6]。隨著IVF-ET 技術(shù)的日益成熟以及成功率的顯著增長[7]，解決了諸多不育癥患者的生育難題。 但是IVF-ET 的活產(chǎn)率仍受到各種因素的影響，包括父母親年齡、體重指數(shù)、精子質(zhì)量、母體陰道和子宮內(nèi)膜微生物組以及著床前后血清孕酮水平等[8]，本文重點(diǎn)回顧分析男性因素與IVF-ET 出生結(jié)局的關(guān)系。

入組對象皆為因女方輸卵管因素不孕行IVF-ET的夫婦，盡可能減少混雜因素對出生結(jié)局的影響。 一般情況方面，活產(chǎn)組與其他各組的男女雙方年齡、體重指數(shù)均無明顯差異。 蔣曉明等[9]則發(fā)現(xiàn)高BMI 組較正常BMI 組臨床妊娠率無顯著差異,但是活產(chǎn)率有下降。 可能與樣本量、地區(qū)飲食結(jié)構(gòu)差異等因素有關(guān)。

通過比較各出生結(jié)局組間的精液參數(shù)發(fā)現(xiàn)， 活產(chǎn)組PR 精子比例較其他各組均顯著增高，提示精子活力可能是出生結(jié)局的重要影響因素。 進(jìn)一步將精子活力由高至低遞減分組，可以發(fā)現(xiàn)出生率呈顯著降低趨勢，從而佐證了精子活力對出生結(jié)局的影響； 但是流產(chǎn)率與精子活力無明顯相關(guān)性，原因一是樣本量偏少，可能存在偏倚， 二是可能與其他因素有關(guān)如精子內(nèi)在DNA損傷、遺傳因素等。 PR 在40%以下患者二胎出生體重較PR≥50%更低，其原因有待進(jìn)一步探究。最后將精液各參數(shù)進(jìn)行Logistic 回歸分析證實(shí)， 精子PR 比例是活產(chǎn)結(jié)局的獨(dú)立危險因素，與出生結(jié)局密切相關(guān)。

關(guān)于精子形態(tài)， 較早有文獻(xiàn)報道精子形態(tài)會影響受精率，進(jìn)而影響臨床妊娠結(jié)局，因此在輔助生殖術(shù)中正常形態(tài)精子比例作為一項重要參數(shù)常用于預(yù)測精子的受精功能是否正常[10]。 潘家坪等[11]發(fā)現(xiàn)精子形態(tài)對IVF 中的受精率有一定影響, 精子正常形態(tài)低于4%時明顯影響IVF 的受精率。 但本研究主要終點(diǎn)與其有所差異，正常精子形態(tài)比例與活產(chǎn)率之間無明顯相關(guān)性。

綜上所述， 本研究發(fā)現(xiàn)取卵當(dāng)日男方精子活力是影響IVF-ET 出生結(jié)局的重要因素，PR 精子比例越高、活產(chǎn)率相對越高。 當(dāng)然本研究對不孕不育樣本的選取有一定的局限性，結(jié)論需進(jìn)一步更大樣本、多中心研究論證。