何鳳明 ，郭加元 ，申 婷 ，馬關(guān)雪，嚴勝柒 ，張云峰 ，2

（1.云南師范大學生命科學學院，昆明 650500；2.生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，昆明 650500）

黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）又稱黑枸杞或大果黑枸杞，為茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium L.）的多年生灌木［1］，主要分布于中國西北荒漠區(qū)［2］。在傳統(tǒng)維、藏、蒙藥中均有記載，用于尿道結(jié)石、癬疥、齒齦出血、明目及降壓藥、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等［3-6］。因富含多糖、類黃酮、氨基酸、維生素及多種微量元素，尤其是較高含量的原花青素，可用于高血壓、冠心病等疾病的預(yù)防［7］。在生態(tài)適應(yīng)性上，黑果枸杞植株在鹽、堿、寒、旱等方面均具較強的抗性，可用于防風固沙及鹽堿地治理［8］，同時還可用于耐性機制的研究和耐性基因的篩選［9］，是一種集生態(tài)、經(jīng)濟、營養(yǎng)、藥用及科研價值為一體的野生灌木樹種［10］。近年來，對黑果枸杞的大量采集造成野生資源的過度破壞，進行人工栽培是惟一的解決途徑［11］，組培快繁可在較短時間內(nèi)培育大量優(yōu)良種苗。

目前有關(guān)黑果枸杞的組培快繁已有多篇報道。如曹君邁等［12］、裴小鵬等［13］、孫曉紅等［14］都以不同外植體進行過黑果枸杞組培快繁的相關(guān)研究。然而這些研究所得結(jié)論并非完全一致。作為一種異交植物，外加風、蟲傳媒及鳥、噬齒動物所介導的種子傳播，黑果枸杞在不同種群間存在一定基因交流［15］，同一種群內(nèi)后代變異性高，后代種子變異大［16，17］。為建立黑果枸杞的高效快繁體系，本研究在對多地區(qū)黑果枸杞單粒干燥漿果原花青素含量測定的基礎(chǔ)上，選取原花青素含量較高的種子進行無菌萌發(fā)，選取其無菌苗葉片為外植體進行組培快繁體系研究，以期為黑果枸杞野生種質(zhì)資源保存和優(yōu)良株系快速繁殖體系建立提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

黑果枸杞購于昆明菊花中藥市場，來源有新疆、甘肅、青海及內(nèi)蒙古。選擇果形好、粒重大的黑果枸杞干燥漿果，將果皮置于2 mL 塑料離心管內(nèi)，稱重后保存用于原花青素的測定。漿果種子保存用于無菌苗的制備。

1.2 方法

1.2.1 黑果枸杞原花青素測定 在盛有漿果表皮的離心管內(nèi)加入1 mL 甲醇，超聲波處理20 min，1 000 r/min 離心5 min，取上清液備用。原花青素測定時，用甲醇將上清液定容至1 mL，隨后分別加入6 mL正丁醇與鹽酸混合液（正丁醇∶鹽酸=95∶5）和0.2 mL硫酸鐵銨溶液，混合后置于沸水中保溫40 min，隨后立即置于冰水中冷卻，在546 nm 處測定吸光度。

標準曲線的制定：稱取原花青素標準品10.0 mg溶于 10 mL 甲醇，分別取 0、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 mL 置于10 mL 容量瓶，加入甲醇至刻度，搖勻。各取1 mL 測定。

原花青素含量（X）=1 000m1v（/1 000×1 000m）

式中，X為樣品中的原花青素含量，mg/100 g；m1為反應(yīng)混合物中的原花青素含量，μg；v為待測樣品體積；m為樣品重量。

1.2.2 黑果枸杞葉片誘導成苗培養(yǎng)基設(shè)計 選取原花青素含量較高的黑果枸杞種子，經(jīng)0.8%的HgCl2消毒8 min 后，用無菌水清洗3 次，種子用無菌濾紙吸干水分，接入種子萌發(fā)培養(yǎng)基（添加了100 mg/L GA3的MS 培養(yǎng)基），接種后將培養(yǎng)瓶置于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)15~20 d。當無菌苗長至5~8 cm 時，取其葉片或莖尖接種于成苗誘導培養(yǎng)基進行成苗誘導。接種后，將培養(yǎng)瓶置于光照度為3 000 lux、溫度為（23±2）℃的培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)。重復3 次，每隔10 d 進行觀察、統(tǒng)計。誘導培養(yǎng)基以MS 為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA、6-BA 及不同的碳源組合，瓊脂濃度為6%。不同碳源組合為在培養(yǎng)基中添加不同濃度的蔗糖和甘露醇，兩者的濃度總和為3%。采用Design-Expert 軟件對 NAA、6-BA 濃度及碳源處理進行三水平設(shè)計，NAA 濃度的高限為0.3 mg/L，低限為 0.1 mg/L；6-BA 的高限為 1.2 mg/L，低限為0.8 mg/L；C 為碳源，蔗糖的高限為3%，低限為2%，碳源總濃度為3%，不足部分用甘露醇補充。

1.2.3 黑果枸杞幼苗生根培養(yǎng)基的選擇 當黑果枸杞幼苗在誘導成苗培養(yǎng)基中長至3~5 cm 時，將幼苗切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進行生根誘導及壯苗培育。采用3 種培養(yǎng)基對其進行生根誘導，分別為1/2MS 培養(yǎng)基+0.3 mg/L NAA+3%糖+0.8%瓊脂、1/2MS 培養(yǎng)基+0.3 mg/L IBA 及 MS 培養(yǎng)基+0.3 mg/L NAA。每瓶生根培養(yǎng)基分別接種10 株幼苗，每隔10 d 統(tǒng)計生根數(shù)量與根長，重復3 次。

1.2.4 成苗過程的切片觀察 外植體接種后8~10 d，在葉片表面，尤其是葉脈及其附近會出現(xiàn)白色凸起，隨后白色凸起逐步形成愈傷，部分愈傷能直接分化為不定芽。試驗就各階段的葉片、形成愈傷及不定芽，采用徒手切片、中性紅染色后進行觀察。

1.2.5 黑果枸杞誘導成苗后移栽 將誘導成功的黑果枸杞取出，洗去培養(yǎng)基，將幾株并在一起，移栽至有腐殖土的花盆中，澆水，移至溫室中培養(yǎng)。

1.2.6 幼苗的遺傳穩(wěn)定性檢驗 幼苗移栽成活后，選擇無損傷的健康葉片400 mg，洗凈后加入液氮研磨，按操作說明用天根“高效植物基因組DNA 提取試劑盒”（DP350）提取全基因組 DNA，DNA 經(jīng)紫外分光光度計檢驗后用于RAPD 擴增以檢測幼苗的遺傳學穩(wěn)定性。擴增引物及擴增條件參考貝盞臨等［18］的報道。

1.3 數(shù)據(jù)的處理及分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 及Design-Expert 8.06軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源黑果枸杞原花青素的含量比較

分別隨機選取10 粒所收集各地的黑果枸杞干燥漿果，進行單粒原花青素含量的測定。圖1 為不同來源單粒干燥漿果的原花青素含量聚類。從圖1可看出，同區(qū)域黑果枸杞在原花青素含量上存在差異，青海黑果枸杞原花青素的含量遠高于其他地區(qū)。后期研究采用青海黑果枸杞作為試驗材料。

2.2 葉片誘導的成苗過程

葉片或莖尖培養(yǎng)5~8 d，葉片部分邊緣及葉脈膨大，10 d后發(fā)生膨大的部位會形成白色凸起（圖2A），葉片上所形成的白色凸起個數(shù)/接種葉片素為誘導響應(yīng)率（表1）。從圖2A可看出，白色凸起主要發(fā)生在葉尖部位，不同葉片的響應(yīng)速度有所差異。莖端葉片的反映較差，而莖中段的反映較好。培養(yǎng)20~25 d發(fā)生膨大的部位會形成綠色愈傷（圖2A、圖2B），愈傷數(shù)量/葉片接種數(shù)為愈傷誘導率（表1），再培養(yǎng)10~15 d，愈傷會分化形成不定芽（圖2A），隨后形成小植株（圖2C），植株數(shù)目/葉片數(shù)為植株形成率（表1）。從圖2A 還可發(fā)現(xiàn)，各葉片的響應(yīng)程度不一致，有的葉片形成白色凸起時，有的葉片已形成綠色愈傷，誘導葉片已形成不定芽（圖2A）。不定芽可直接從葉緣長出（圖2A、圖2C），且一個葉片可長出多個不定芽（圖2B、圖2C），對綠色愈傷的切片觀察，發(fā)現(xiàn)愈傷內(nèi)具類胚狀體的結(jié)構(gòu)（圖2G），且可直接形成幼芽（圖2H），表明不定芽可能是以胚狀體途徑形成。幼苗長至2~3 cm 時將幼苗切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)（圖2E）。

2.3 一次成苗誘導培養(yǎng)基的優(yōu)化

利用Design-Expert 軟件對激素濃度及C 源組合進行三水平設(shè)計，共得17 個處理組合，對各處理誘導響應(yīng)率、愈傷誘導率及植株形成率進行觀察、統(tǒng)計（表1）。表2 為各因素對葉片誘導響應(yīng)率的方差分析，從表 2 可看出，6-BA、NAA、C 3 個因素對葉片誘導響應(yīng)率均呈顯著性差異（P≤0.05）。Design-Expert 8.06 軟件模擬所得回歸模型的P值為0.005 1≤0.05，失擬項的P值為0.720 2≥0.05，表明方程擬合度好。各因素對誘導響應(yīng)率的模擬回歸方程為：Y=869.0-770.4X1-648.1X2-254.3X3-41.7X1X2+52.5X1X3+160.0（式中Y為響應(yīng)率，X1、X2、X3分別為 6-BA、NAA 及 C 源）?；貧w方程解析后，誘導的最佳條件為0.92 mg/L 6-BA、0.45 mg/L NAA、2.26%C 源（蔗糖為 2.26%，甘露醇濃度為0.74%），誘導響應(yīng)率最高，白色凸起的誘導需要相對高的生長素和滲透壓。

圖3 為Design-Expert 8.06 軟件分析所得的誘導響應(yīng)率的響應(yīng)面及等高線。等高線的形態(tài)可反映因素間交互作用的大小，圓形表示交互作用小，橢圓形則相反［19］，而響應(yīng)面的坡度變化可反映出各因素對響應(yīng)值的影響力，坡度越緩表明影響越?。?0，21］。由圖 3 可看出，C 源組合與 6-BA 及 NAA 濃度的互作強度大，響應(yīng)面中生長素、C 源組合的坡度也陡，表明對誘導響應(yīng)率的影響大。碳源對6-BA 和NAA 的互作強度大，表明這兩種激素對葉片凸起的影響在很大程度上受C 源組合的影響。

表1 黑果枸杞葉片培養(yǎng)過程中的誘導響應(yīng)率、愈傷誘導率及植株形成率

圖4 為Design-Expert 8.06 軟件分析所得的愈傷誘導率的響應(yīng)面及等高線，從圖4 可看出，愈傷誘導率的響應(yīng)面及等高線與誘導響應(yīng)率（圖3）非常類似，表明3 因素對愈傷誘導率的影響與對誘導響應(yīng)率的影響是一致的。表2 為各因素對葉片愈傷誘導率回歸方程的方差分析，各因素對葉片愈傷誘導率的影響回歸方程為：Y=2 179.3-1 528.6X1-1 581.4X2-從表 2 可看出，模型的P值≤ 0.05，失擬項的P值為0.720 2≥0.05，表明方程擬合度好。誘導的最佳條件與誘導響應(yīng)率一致。

圖5 為Design-Expert 8.06 軟件分析所得的植株形成率的響應(yīng)面及等高線，從圖5 可看出，各因素對植株形成誘導率的影響與誘導響應(yīng)率及愈傷誘導率有一定差異，響應(yīng)面及等高線均反映出C 源濃度對植株形成率的影響較小，這也反映在方差分析中（表2）。6-BA 及NAA 濃度對植株形成率呈顯著性差異（P≤0.05），而C源的影響不顯著。各因素對葉片直接形成植株率影響的回歸方程為：Y=-181.3-329.0X1+382.9X2+208.0X3+30.8X1X2+60.4X1X3-186.1X2X3+植株形成率的最佳條件為 6-BA 為 1.15 mg/L，NAA 為 0.38 mg/L，C源組合蔗糖為2.93%，表明在植株形成過程中需要較高的細胞分裂素和蔗糖。

表2 回歸方程方差分析

2.4 黑果枸杞誘導生根培養(yǎng)基的選擇

黑果枸杞誘導幼苗接種在生根培養(yǎng)基上20 d后，可發(fā)現(xiàn)幾乎所有幼苗都能生根（圖2F），甚至葉片都能生根，表明黑果枸杞較易生根。對生根狀況進行統(tǒng)計得到表3 所示的結(jié)果。從生根率及根長上看，1/2MS 更合適，但在株高上 1/2MS 與 MS 沒有差異，在激素選擇上NAA 的生根誘導效果更好。

表3 生根培養(yǎng)基對幼苗生根狀況的影響

2.5 幼苗的遺傳穩(wěn)定性

在切片觀察中，發(fā)現(xiàn)誘導過程中不定芽可直接從葉邊緣長出，且多數(shù)葉片可形成多個不定芽。發(fā)現(xiàn)綠色愈傷的切片有類胚狀體結(jié)構(gòu)（圖2G），這些類似胚狀體結(jié)構(gòu)可直接萌發(fā)為芽（圖2F），但在所有的不定芽中沒有發(fā)現(xiàn)生根現(xiàn)象。參照貝盞臨等［18］的方法，隨機選擇了10 株黑果枸杞生根幼苗進行RAPD 擴增，發(fā)現(xiàn)所有幼苗的條帶一致（圖2I），表明采用該途徑所誘導的幼苗在遺傳上是穩(wěn)定的。

3 小結(jié)與討論

試驗利用響應(yīng)面設(shè)計軟件Design-Expert 8.06就6-BA、NAA 及C 源組合進行了三水平設(shè)計，以期得到黑果枸杞葉片一次誘導成苗的最佳誘導培養(yǎng)基。結(jié)果表明，雖然激動素、細胞分裂素及C 源對誘導響應(yīng)率及愈傷誘導率的影響顯著，但生長素與C源組合的影響相對較大，同時C 源組合與6-BA 及NAA 濃度的互作強度大。表明細胞分裂在很大程度上受C 源組合的影響。C 源在培養(yǎng)基中，除為外植體提供營養(yǎng)外，還承擔維持外植體細胞滲透壓的功能。在植物細胞及組織的體外培養(yǎng)過程中，C 源既為植物細胞提供營養(yǎng)，同時也是細胞環(huán)境的滲透壓調(diào)節(jié)劑。研究表明，植物細胞形成愈傷主要是源于干細胞的預(yù)先存在群（Pre-existing population of stem cells）或那些已脫分化的細胞，表明干細胞或類干細胞在植物愈傷的形成過程中起到重要作用［22］。植物干細胞往往具有許多微小液泡，對滲透壓的耐性較強［23］。利用滲透壓預(yù)先處理外植體已成為分離、培養(yǎng)植物干細胞的一種重要方式。在諸如大葉落地生根（Kalanchoe daigremontiana）、石蓮花（Grap?topetalum paraguayense）和燕子掌（Crassula portula?cea）的無性生殖中，葉片上可直接萌發(fā)出芽，而這些芽多發(fā)生在有干細胞的葉柄附近［24，25］。研究表明，在葉柄的愈傷誘導過程中，位于維管束附近的類干細胞-原形成層細胞較其他細胞較易存活［26］，這些預(yù)先存在的干細胞或類干細胞能產(chǎn)生信號，通過細胞間的細胞通訊促進周圍細胞的脫分化［27］。參考《中華人民共和國藥典》二部附件IXG 有關(guān)毫滲透壓摩爾濃度（mOsmol/kg）的計算公式，試驗中白色突起及愈傷誘導的優(yōu)化培養(yǎng)基中的毫滲透壓摩爾濃度為106.64 mOsmol/kg，而傳統(tǒng)采用3%蔗糖培養(yǎng)基的毫滲透壓摩爾濃度為87.64 mOsmol/kg，優(yōu)化培養(yǎng)基的毫滲透壓摩爾濃度較傳統(tǒng)普通培養(yǎng)基高21.68%，表明滲透壓的確可提高誘導響應(yīng)率及愈傷誘導率。當然，試驗所得幼苗是否直接源于干細胞所形成的胚狀體還需要更多的證據(jù)。

試驗在培養(yǎng)誘導過程中，通過調(diào)整C 源的組合，實現(xiàn)了利用無菌苗葉片進行黑果枸杞一次成苗的高效誘導。作為一種試驗設(shè)計與數(shù)學建模相結(jié)合的優(yōu)化方法，響應(yīng)面設(shè)計可通過局部試驗，以回歸擬合的方式體現(xiàn)全局范圍內(nèi)各因素與響應(yīng)值間的函數(shù)關(guān)系，計算出各因素最佳值及因素間的互作強度［28］。結(jié)果表明，誘導響應(yīng)率及愈傷誘導率的最佳條件為6-BA 0.92 mg/L、NAA 0.45 mg/L、C 源 組 合 蔗 糖2.26%；且C 源組合與6-BA 及NAA 濃度的互作強度大，采用響應(yīng)面設(shè)計進行因素最佳范圍尋找所得的結(jié)果更為精細。