楊金宏，陳正余，孟 剛，孔衛(wèi)青

（安康學(xué)院/陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 安康 725099）

桑葚是由大量小核果集合而成為的聚花果果實(shí)，是國(guó)家“既是食品又是藥品（1985）”的農(nóng)產(chǎn)品之一，并被列入《中華人民共和國(guó)藥典》，具有很高的食藥用價(jià)值。桑葚富含黃酮、綠原酸、原花青、多糖、有機(jī)酸等活性物質(zhì)，具有保護(hù)神經(jīng)、提高免疫力、減肥、預(yù)防癌癥、糖尿病、心血管疾病等功效［1］。同時(shí)，成熟桑葚還含豐富的花青素（矢車菊素-3-葡萄糖苷）（C3G）成分，具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)血管彈性、消炎抗過敏等功效［1-3］。在韓國(guó)和日本，桑葚也被用于民間醫(yī)藥藥理作用，包括退燒、治療喉嚨痛、肝腎保護(hù)、視力改善以及降血壓等［4，5］。

桑葚可新鮮食用，也可干燥或加工成酒、果汁和果醬，味道鮮美，熱量低、營(yíng)養(yǎng)高，深受大眾喜愛。隨著近年來(lái)人們保健意識(shí)的增強(qiáng)，果酒以其低酒度、時(shí)尚、個(gè)性化等元素，很好地滿足了人們對(duì)時(shí)尚酒精飲料的認(rèn)同和追求。利用天然釀酒酵母，將新鮮桑葚榨汁糖發(fā)酵轉(zhuǎn)化為酒精生產(chǎn)的桑果酒，酒質(zhì)醇厚芳香、酒體清亮透明［6］，深受消費(fèi)者喜愛，但相關(guān)制品活性成分的含量及其功效等未見研究報(bào)道。本研究對(duì)采摘自中度富硒土壤的桑果原汁和桑果酒進(jìn)行研究，測(cè)定了其中的類黃酮、總酚、原花青素、綠原酸、C3G、木犀草苷和硒等的含量，及其總抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 桑葚品種紅果2 號(hào)，采摘自安康市石泉縣城關(guān)鎮(zhèn)，選取成熟度高、含糖量高、無(wú)霉變及病蟲害的新鮮桑葚，利用打漿機(jī)制作桑果原汁。桑果酒的制作：桑果原汁加入0.008%（W/V）SO2，0.1%（W/V）的釀酒酵母，22 ℃發(fā)酵7 d，桑果原汁和桑果酒在陜西博硒農(nóng)業(yè)科技有限公司制作完成。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 Agilent 1100 高效液相色譜儀、Thermo X Series II 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀。Millipore 超純水系統(tǒng)、Multiskan Sky 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，低溫離心機(jī)Microfuge 22R、離心機(jī)Z-160M 等。

1.1.3 主要試劑 沒食子酸、蘆丁、兒茶素、綠原酸、木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)自中國(guó)計(jì)量所；硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg/mL）購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；乙腈、硝酸為優(yōu)級(jí)純；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、稀鹽酸、磷酸二氫鉀等為分析純，購(gòu)自天津化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 總酚含量測(cè)定 分別取桑果原汁和桑果酒0.5 mL，針頭式過濾器（0.22 μm）過濾，福林酚試劑法［7］測(cè)定其總酚含量，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定760 nm 吸光度并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算桑果原汁和桑果酒總酚含量。

1.2.2 原花青素含量測(cè)定 原花青素含量測(cè)定采用香草醛法［8］，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定 500 nm 吸光度并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品原花青素含量。

1.2.3 類黃酮含量測(cè)定 類黃酮含量的測(cè)定采用亞硝酸鹽比色法［9］，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定 510 nm 吸光度并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品類黃酮含量。

1.2.4 綠原酸含量測(cè)定 綠原酸含量使用HPLC 方法［10］，流動(dòng)相 A 為甲醇，B 為 1% 乙酸水，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。配制0.5、2.0、16.0、80.0、200.0、400.0 μg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液測(cè)定并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品綠原酸含量。

1.2.5 C3G含量測(cè)定 C3G含量測(cè)定方法同“1.2.4”，流動(dòng)相A 為1.6%甲酸水溶液，B 為1.6%甲酸甲醇溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)530 nm。配制2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL 的C3G 標(biāo)準(zhǔn)品溶液測(cè)定并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的C3G 含量。

1.2.6 木犀草苷含量測(cè)定 木犀草苷含量測(cè)定方法同“1.2.4”，流動(dòng)相A 為1%乙酸水溶液、流動(dòng)相B 甲醇，檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm。配制0.1、1.0、10.0、40.0、100.0、200.0 μg/mL 木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液測(cè)定并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品木犀草苷含量。

1.2.7 硒含量測(cè)定 樣品硒含量采用ICP-MS 方法［11］測(cè)定，配制 0、5、10、20、30 μg/L 的系列硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作硒溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品硒含量。

1.2.8 對(duì)羥基自由基的清除作用 采用鄰二氮菲-Fe2+比色法計(jì)算樣品羥自由基清除能力［12］，測(cè)定樣本吸光度記為A測(cè)，去離子水代替樣品作對(duì)照的吸光度記為A對(duì)，去離子水代替H2O2測(cè)吸光度記為A空，根據(jù)公式D=（A測(cè)-A對(duì)）/（A空-A對(duì)）×100%計(jì)算樣品的羥自由基清除率。

1.2.9 抗氧化活性測(cè)定 制備FRAP 工作液［13］，分別取桑果原汁和桑果酒6 μL，加入預(yù)熱至37 ℃的FRAP 工作液 180 μL、ddH2O 18 μL，反應(yīng) 20 min 后，酶標(biāo)儀測(cè)定593 nm 吸光度，測(cè)定以雙蒸水為空白對(duì)照。以0.2~1.6 mmol/L FeSO4溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每克樣本每分鐘產(chǎn)生1 μmol Fe2+-TPTZ 定義為一個(gè)酶活力單位，計(jì)算樣品的總抗氧化活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有樣品均平行測(cè)定3 次，結(jié)果以x±s表示，顯著性和極顯著值分別為P<0.05 和P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑果原汁和桑果酒各成分含量測(cè)定結(jié)果

2.1.1 總酚含量測(cè)定結(jié)果 用沒食子酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程y=2.808x+0.001 2，R2=0.999 7，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，說明吸光度與濃度之間存在較好的線性關(guān)系，試驗(yàn)的準(zhǔn)確性高。進(jìn)一步測(cè)得桑果原汁中總酚含量為（6.085±0.202）mg/mL，桑果酒總酚含量為（1.633±0.088）mg/mL，二者差異極顯著（P=0.001 0）。

2.1.2 原花青素含量測(cè)定結(jié)果 獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.009 7x+0.000 6，R2=0.999 9。測(cè)得桑果原汁和桑果酒的原花青素含量分別為（1.838±0.097）、（0.345±0.071）mg/mL，二者差異極顯著（P=0.002 7）。

2.1.3 類黃酮含量測(cè)定結(jié)果 獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=2.51x+0.000 7，R2=0.999 6。測(cè)得桑果原汁和桑果酒的類黃酮含量分別為（7.675±0.142）、（0.570±0.063）mg/mL，二者差異極顯著（P=0.000 2）。

2.1.4 綠原酸含量測(cè)定結(jié)果 綠原酸的保留時(shí)間是6.157 min，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=15.371x-15.504，R2=0.999 6，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，說明峰面積與濃度之間存在較好的線性關(guān)系。測(cè)得桑果原汁和桑果酒的綠原酸含量分別為（11.550±0.508）、（1.453±0.108）μg/mL。

2.1.5 C3G 含量測(cè)定結(jié)果 C3G 的保留時(shí)間是24.793 2 min（圖 1），測(cè)得桑果原汁中 C3G 含量為81.476±2.417 μg/mL，桑果酒中沒有檢測(cè)到C3G。

2.1.6 木犀草苷含量測(cè)定結(jié)果 木犀草苷的保留時(shí)間是5.160 1 min（圖2），測(cè)得桑果原汁和桑果酒中木犀草苷的含量分別為（6.750±0.706）、（1.061±0.205）μg/mL。

2.1.7 硒含量測(cè)定結(jié)果 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=147.26x+41.603，R2=0.999 8，測(cè)得桑果原汁中硒含量為（2.221±0.034）μg/L，桑果酒中硒含量為（2.246±0.118）μg/L，二者間差異不顯著（P=0.881 9）。兩個(gè)樣品硒含量均未達(dá)到國(guó)家富硒食品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定（≥ 10 μg/L）。

2.2 桑果原汁和桑果酒抗氧化活性

2.2.1 羥自由基清除率 羥自由基清除率是樣品抗氧化能力的重要指標(biāo)之一，測(cè)得桑果原汁羥自由基清 除 率 為（6.533±1.260）% ，桑 果 酒 為（11.030±0.321）%，二者差異顯著（P=0.014 4）。

2.2.2 對(duì)鐵離子的還原能力 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.422 1x-0.004 8，R2=0.997 9，桑果原汁和桑果酒對(duì)鐵離子的還原力分別為（2 363.696±129.319）、（108.614±4.789）U/mL，二者差異極顯著（P=0.001 0）。

3 小結(jié)與討論

桑葚鮮果含有大量的水分（80%~85%），不能保存，進(jìn)行干制、釀酒或進(jìn)行活性成分提取［14］是目前桑葚儲(chǔ)存和利用的主要出路。試驗(yàn)對(duì)桑葚直接榨汁和釀造果酒的功能成分和抗氧化活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)桑果原汁的總酚、原花青素、類黃酮、綠原酸、木犀草苷和矢車菊素-3-葡萄糖苷（C3G）等成分的含量均顯著高于桑果酒，二者的硒含量無(wú)顯著差異。這可能與桑果原汁直接來(lái)自桑葚，未經(jīng)過任何加工，能夠較好保存桑葚有效成分有關(guān)。

進(jìn)一步測(cè)定顯示，桑果原汁對(duì)鐵離子還原能力顯著優(yōu)于桑果酒，而桑果酒對(duì)羥自由基的清除率優(yōu)于桑果原汁。羥自由基具有強(qiáng)氧化能力，可作用于體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等生物分子，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能受損，體內(nèi)代謝紊亂，引起疾病。桑果酒的羥自由基清除率更高，說明桑果酒也是一種具有很好發(fā)展前景的健康產(chǎn)品。由于試驗(yàn)所測(cè)指標(biāo)多依據(jù)桑葚成分確定，且僅對(duì)成酒前后進(jìn)行了比較，而桑果酒釀造過程中的真菌發(fā)酵產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物、動(dòng)力學(xué)變化及其對(duì)桑果酒保健功能的作用有待于進(jìn)一步的研究。