張旭東，李嘯飛，楊中鐸

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730050）

近年來，天然產(chǎn)物已成為尋求高生物活性物質(zhì)和新藥前體的主要路徑，天然產(chǎn)物作為藥物的主要來源，種類豐富，數(shù)量龐大，毒副作用小。植物內(nèi)生真菌不僅能夠參與植物次生代謝產(chǎn)物的合成以及對植物次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，還能獨(dú)立產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，是天然產(chǎn)物的重要來源，是一類具有高度開發(fā)價值的新型生物資源，對其的研究已經(jīng)成為微生物學(xué)研究的一大熱點(diǎn)。

雷公藤（Tripterygium wilfordii）為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，是傳統(tǒng)的中藥材，性苦、寒，具有清熱解毒、祛風(fēng)通絡(luò)、舒筋活血等功效，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎炎、紅斑狼瘡、血小板減少性紫癜等［1］。經(jīng)過長期的研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與宿主相似甚至相同的次級代謝產(chǎn)物，其中包括抗腫瘤、抗炎、抗菌等多方面的天然產(chǎn)物。目前已經(jīng)有多種藥用植物的代謝產(chǎn)物應(yīng)用于臨床，在醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮著舉足輕重的作用。

本課題組從雷公藤中分離得到了一株踝節(jié)菌屬內(nèi)生真菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為踝節(jié)菌屬（Talaro?myces）Talaromyces wortmannii，又名籃狀菌，是青霉菌屬（Penicillium）的一個亞屬。該屬真菌能代謝出豐富的新次級代謝產(chǎn)物，包括生物堿、多肽、內(nèi)酯、聚酮等類化合物。其中，生物堿（Alkaloid）是廣泛存在于自然界中的一類含氮的堿性化合物，有顯著的生物活性，是中草藥中重要的有效成分之一［2］；酯類（Esters）化合物是踝節(jié)菌屬真菌的最主要次級代謝產(chǎn)物［3］；聚酮（Polyketides）是一類由細(xì)菌、真菌、植物與動物所生產(chǎn)出來的次級代謝產(chǎn)物，可用于抵抗病蟲害［4］。在抗生素、細(xì)胞穩(wěn)定（Cytostatic）和天然殺蟲劑等領(lǐng)域具有極高的價值；多肽主要控制人體的生長、發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)和新陳代謝［5］。前期研究表明，該菌株能產(chǎn)生許多新化合物如Secovironolide、Epoxyvirone［6］和 Wortmannolol［7］。 為 了 進(jìn) 一 步 從 該菌株中獲得結(jié)構(gòu)新穎、具有一定藥理活性的化合物，本研究對Talaromyces wortmanniiLGT-4 的改良馬丁氏培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)成分和生物活性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及材料 踝節(jié)菌屬真菌Talaromyces wortmanniiLGT-4（GenBank 收錄號：KF850714）為本課題組前期從藥用植物雷公藤根中分離得到的一株植物內(nèi)生真菌，該菌株現(xiàn)保存于蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院。

1.1.2 培養(yǎng)基 改良馬丁氏培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸氫二鉀1 g，酵母浸出粉2 g，硫酸鎂0.5 g，去離子水1 L。

1.1.3 儀器 600 MHz 液體超導(dǎo)核磁共振波譜儀；雙泵雙波長高效液相色譜；Bruker Daltonics APEXⅡ47e質(zhì)譜儀；BioTek 酶標(biāo)儀 Elx808；96 孔酶標(biāo)板。

1.2 方法

1.2.1 次級代謝產(chǎn)物的提取分離方法 將活化好的Talaromyces wortmanniiLGT-4 接 入 50 L 發(fā) 酵 罐 中 發(fā)酵25 d。發(fā)酵結(jié)束后，將菌絲與菌液分離，用乙酸乙酯對菌液等體積萃取，共得到Talaromyces wortman?niiLGT-4 改良馬丁氏培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物浸膏10 g。經(jīng)大孔吸附樹脂分離，乙醇-水梯度洗脫（10%、30%、50%、70%、90%），得到4 個組分，分別為G-A（1.5 g）、G-B（3.0 g）、G-C（2.5 g）、G-D（1.5 g）。

G-A 組分用硅膠柱層析，二氯甲烷∶甲醇（30∶1、20∶1、8∶1、5∶1、2∶1）梯度洗脫，得到4 個組分：G-AA、G-A-B、G-A-C、G-A-D。G-A-C（300 mg）用高效液相色譜（流速1.2 mL/min，流動相53%的甲醇水，tR=18 min）分離得到化合物 9（2 mg），G-A-D（390 mg）用高效液相色譜（流速0.8 mL/min，流動相32%的甲醇水，tR=21min）分離得到化合物4（1.8 mg）。

G-B組分用MCI柱層析，甲醇水（20%、30%、40%、50%、60%、100%）梯度洗脫，得到5 個組分：G-B-A、G-B-B、G-B-C、G-B-D、G-B-E。G-B-C（800 mg）用硅膠柱層析，石油醚∶丙酮（50∶1、30∶1、10∶1、8∶1、5∶1）梯度洗脫，得到 3 個組分 G-B-C-A、G-B-C-B和G-B-C-C。其中G-B-C-B 組分（92 mg）用高效液相色譜（流速1.5 mL/min，流動相62%的甲醇水，tR=25.2 min）分離，得到化合物 7（20 mg），G-B-D 選用硅膠柱層析，石油醚∶丙酮（30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1）梯度洗脫，得到4 個組分G-B-D-A、G-B-D-B、G-B-D-C和G-B-D-D。其中G-B-D-B組分（40 mg）用高效液相色譜（流速1.2 mL/min，流動相66%的甲醇水，tR=44.8min）分離，得到化合物5（1.2 mg）。

G-C組分用MCI柱層析，甲醇水（20%、40%、50%、60%、80%、100%）梯度洗脫，得到5 個組分：G-C-A、G-C-B、G-C-C、G-C-D、G-C-E。G-C-B（560 mg）選用硅膠柱層析，石油醚∶丙酮（30∶1、20∶1、10∶1、5∶1）梯度洗脫，得到 G-C-B-A、G-C-B-B。G-CB-A（60 mg）使用高效液相色譜（流速1.2 mL/min，流動相47%的甲醇水，tR=46.6 min）分離，得到化合物2（3 mg）。G-C-B-B（70 mg）用高效液相色譜（流速0.8 mL/min，流動相 27%的乙腈水，tR=18.1 min）分離，得到化合物6（2 mg）。G-C-C（630 mg）選用硅膠柱層析，二氯甲烷∶丙酮（30∶1、20∶1、15∶1、6∶1、3∶1）梯度洗脫，得到組分G-C-C-C（72 mg），使用葡聚糖凝膠LH-20 分離，用氯仿甲醇1∶1 洗脫，得到化合物3（10 mg）。G-C-D（320 mg）選用硅膠柱層析，石油醚∶丙酮（100∶1、30∶1、20∶1、15∶1、10∶1）梯度洗脫，得到 2 個組分G-C-D-A 和G-C-D-B。其中G-CD-A 組分（45 mg）用高效液相色譜（流速0.8 mL/min，流動相47%的甲醇水，tR=23min）分離，得到化合物1（1.6 mg）。

G-D 組分選用MCI 柱層析，甲醇水（40%、50%、60%、70%、80%、100%）梯度洗脫，得到3 個組分：GD-A、G-D-B、G-D-C。G-D-A（200 mg）選用硅膠柱層析，石油醚∶丙酮（120∶1、80∶1、30∶1、20∶1、10∶1）梯度洗脫，得到化合物10（12 mg）。G-D-B（250 mg）選用硅膠柱層析，石油醚∶丙酮（60∶1、35∶1、30∶1、20∶1、10∶1）梯度洗脫，得到化合物8（30 mg）。

1.2.2 次級代謝產(chǎn)物的生物活性測定

1）乙酰膽堿酯酶抑制活性測定。采用改進(jìn)的Ellman 法（酶標(biāo)法）對分離出的化合物進(jìn)行乙酰膽堿酯酶抑制活性評價，測定方法同文獻(xiàn)［8］。其樣品終濃度均為30 μg/mL，用石杉堿甲作為陽性藥。

2）磷脂酰肌醇3-激酶抑制活性測定。采用體外激酶檢測試劑盒的方法測定了樣品的PI3K 抑制活性，通過檢測磷脂酰肌醇3-激酶反應(yīng)后生成ADP的量來確定化合物的抑制率，測定方法同文獻(xiàn)［9］。樣品終濃度均為0.2 μg/mL，陽性藥為GDC-0941。

1.3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

從踝節(jié)菌屬真菌Talaromyces wortmanniiLGT-4改良馬丁氏培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到10 種化合物，運(yùn)用1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS 等現(xiàn)代波譜技術(shù)，結(jié)合文獻(xiàn)比對，對分離的10 個化合物進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物鑒定結(jié)果

從踝節(jié)菌屬真菌Talaromyces wortmanniiLGT-4改良馬丁氏培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到10 種化合物，結(jié)合文獻(xiàn)比對，對分離的10 個化合物進(jìn)行了鑒定。分別鑒定為Cyclo-（Pro-Ile）（1）、Cyclo（L-Tyr-L-Leu）（2）、Cyclo-（L-Pro-L-Phe）（3）、Aspergillu?marin B（4）、Deacetylisowortmin（5）、Chaetominine（6）、（E）-2-（hydroxymethyl）-3-（2-hydroxypent-3-enyl）phenol（7）、N-（2-Phenylethyl）acetamide（8）、4-hydroxynaphthalide（9）、1，2-Benzenedicarboxylic acid，dibuty ester（10）。

2.2 乙酰膽堿酯酶抑制活性

采用Ellman 法對10 個單體化合物的抗AChE 活性進(jìn)行了測定，結(jié)果見表1。單體化合物的初濃度為300 μg/mL（終濃度為30 μg/mL），陽性藥石杉堿甲的IC50=（0.31±0.12）μg/mL?；衔? 表現(xiàn)出較好的抗乙酰膽堿酯酶的活性，IC50為11.76 μg/mL。

2.3 磷脂酰肌醇3-激酶抑制活性

采用體外激酶檢測試劑盒的方法，對10個單體化合物的抗PI3K 活性進(jìn)行了測定，結(jié)果見表2。單體化合物的初濃度為20 μg/mL（終濃度為0.2 μg/mL），陽性藥GDC-0941的IC50為（4.5±0.2）nmol/L。結(jié)果表明化合物均沒有很好的抗磷脂酰肌醇3-激酶活性。

3 小結(jié)與討論

研究從Talaromyces wortmanniiLGT-4 改良馬丁氏培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到10 個單體化合物，其中化合物 1、2、3、6、8 為首次從該真菌中分離得到。采用酶標(biāo)法及激酶檢測試劑盒的方法，對10 個單體化合物進(jìn)行了抗乙酰膽堿酯酶、抗磷脂酰肌醇3-激酶的活性測定。結(jié)果表明，化合物1 具有較好的抗乙酰膽堿酯酶的活性，IC50為11.76 μg/mL?；衔锏目沽字＜〈?-激酶活性均比較弱。到目前為止，未見對本研究中分離化合物的抗乙酰膽堿酯酶和抗磷脂酰肌醇3-激酶活性的報道。

表1 10 種化合物抗乙酰膽堿酯酶活性

表2 10 種化合物抗磷脂酰肌醇3-激酶抑制活性

Chen 等［10］研 究 發(fā) 現(xiàn) ，N-（2-Phenylethyl）acet?amide（8）具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制作用，其IC50為（75.87±4.86）μmol/L，同時還具有抗hepG2 細(xì)胞增殖的作用，其IC50為（133.56±10.69）μmol/L。Ji?ao 等［11］從沙參內(nèi)生真菌Chaetomiumsp. IFBE015 中分離得到Chaetominine（6），發(fā)現(xiàn)Chaetominine（6）相比于5-氟尿嘧啶具有更好的人類白血病K562 細(xì)胞和結(jié)腸癌 SW1116 細(xì)胞毒性，表明 Chaetominine（6）具有成為抗癌藥物的潛力。本研究首次報道了化合物7 的抗乙酰膽堿酯酶活性，由于乙酰膽堿酯酶抑制劑常用于阿爾茨海默癥的治療，因此化合物7 可能具有抗阿爾茨海默癥作用，有待于進(jìn)一步研究。