聶子頁， 王丹丹， 周振芳， 張嬌嬌， 劉鴻艷， 林 田， 吳文嬙

(1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院， 海口 570228； 2.海南大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)院， ?？?570228； 3.上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心， 上海 201106)

參薯(DioscoreaalataL.)又名大薯、腳板薯、菜山藥，隸屬于薯蕷科薯蕷屬周生翅組纏繞草質(zhì)藤本植物[1]。參薯在我國主要分布在長江以南，其塊莖富含蛋白質(zhì)、淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)[2]，是我國傳統(tǒng)的蔬菜，是非洲熱帶地區(qū)的主糧[3]。其莖葉含較高的粗蛋白(19.55%)和較低的單寧(0.66%)，可用作飼料[4]。由于參薯長期依靠地下塊莖無性繁殖，導(dǎo)致生產(chǎn)中病害逐年累積、種性下降、種質(zhì)資源逐漸滅絕，通過離體組織培養(yǎng)可以保存珍貴的資源[5]。然而隨著資源收集數(shù)量的增加，離體保存需要投入較大的人力物力，通過限制生長保存可以減少繼代次數(shù)，節(jié)省勞力。

表2 培養(yǎng)150 d時Da 70在不同蔗糖濃度處理下的生長抑制情況

延緩植物生長的主要方法有：添加不同生長抑制劑和不同高滲物質(zhì)、調(diào)整培養(yǎng)基成分以及降低培養(yǎng)溫度等[6]。目前，已經(jīng)有許多塊莖類植物探討了相關(guān)限制植物生長保存的研究，如：馬鈴薯[7]、山藥[8-9]、黃獨[10]等。國外報道了在不同ABA、甘露醇、山梨醇濃度處理下對參薯緩慢生長影響的研究[11]，國內(nèi)未見相關(guān)報道。常使用的高滲物質(zhì)有蔗糖、甘露醇、山梨醇等[12]。本研究擬通過添加蔗糖、甘露醇和山梨醇3種不同濃度的高滲物質(zhì)，提高培養(yǎng)基滲透勢負值，研究在不同濃度水平下，對參薯離體保存植株的存活率及生長狀況的影響，為建立參薯離體種質(zhì)資源中期保存提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料為海南大學(xué)薯蕷課題組提供的參薯70號(Da 70，云南瑞麗)組培苗，蔗糖、甘露醇、山梨醇分別購自西隴科學(xué)、Solarbio、Biofroxx。

1.2 方 法

以MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂+0.1%PVP為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將Da 70材料接種到添加不同濃度蔗糖、甘露醇、山梨醇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上進行限制生長，濃度設(shè)置見表1。在光照12 h·d-1，溫度(25±2)℃下培養(yǎng)，30 d、60 d、90 d、150 d記錄苗株高、葉片數(shù)及存活率。觀察不同處理對材料生長限制的影響。每個處理3個重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

采用SPSS 23.0軟件和Microsoft Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，實驗數(shù)據(jù)均為平均值±SD。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蔗糖濃度對參薯Da 70試管苗限制生長的影響

采用5個不同蔗糖濃度處理Da 70帶芽莖段，研究結(jié)果表明，室溫下10～70 g·L-1范圍內(nèi)，隨著蔗糖濃度的升高，試管苗的生長加快。在培養(yǎng)30～150 d，10 g·L-1蔗糖處理的不同階段，試管苗株高均低于其他處理，其中在90～150 d時顯著低于其他處理。在培養(yǎng)30～90 d，50 g·L-1和70 g·L-1蔗糖處理的試管苗生長迅速且株高顯著高于對照，尤其在60～90 d，株高差異更顯著；在150 d時，試管苗置頂，高度差異無法比較(圖1、圖2)。在培養(yǎng)150 d時，不同處理的試管苗生長狀態(tài)和存活率有顯著差異。10 g·L-1蔗糖處理時，試管苗的葉片較小，顏色保持嫩綠；50 g·L-1和70 g·L-1蔗糖處理時，試管苗多數(shù)死亡，存活率顯著下降(表2)。表明低濃度蔗糖處理能夠有效抑制Da 70生長，延長生長時間；在高濃度蔗糖處理下，則會促進試管苗的生長，并加快早衰或死亡。

表1 不同濃度高滲物質(zhì)處理

2.2 不同甘露醇濃度對參薯Da 70試管苗限制生長的影響

采用5個不同濃度甘露醇處理Da 70帶芽莖段，研究結(jié)果表明，室溫下，0～40 g·L-1范圍內(nèi)，隨著甘露醇濃度的升高，試管苗生長減慢。在培養(yǎng)30～150 d，30 g·L-1和40 g·L-1甘露醇處理的試管苗生長緩慢，且顯著低于對照以及其他處理，尤其在60～90 d，生長較慢(圖3、圖4)。在培養(yǎng)150 d時，不同濃度處理的試管苗生長狀態(tài)有顯著差異，在0～30 g·L-1濃度范圍內(nèi)，試管苗存活率高且無顯著差異，在40 g·L-1甘露醇處理下，試管苗存活率顯著下降。在30 g·L-1甘露醇處理下，試管苗的葉片較小，顏色保持嫩綠。綜合試管苗株高、存活率及生長狀態(tài)，30 g·L-1處理的試管苗明顯優(yōu)于40 g·L-1處理的試管苗(表3)。表明高濃度甘露醇處理能有效抑制Da 70試管苗生長，延長生長時間。

注：同時間段上不同字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。

圖2 培養(yǎng)150 d時不同蔗糖濃度處理對Da 70的影響

表3 培養(yǎng)150 d時Da 70在不同甘露醇濃度處理下的生長抑制情況

表4 培養(yǎng)150 d時Da 70在不同山梨醇濃度處理下的生長抑制情況

圖3 不同甘露醇濃度對Da 70的影響

2.3 不同山梨醇濃度對參薯Da 70試管苗限制生長的影響

采用5個不同山梨醇濃度處理Da 70帶芽莖段，研究結(jié)果表明，室溫下 0～40 g·L-1范圍內(nèi)，隨著山梨醇濃度的升高，試管苗的株高以及存活率沒有顯著變化(表4、圖5)。表明不同山梨醇濃度的處理并未抑制Da 70試管苗的生長。

圖4 培養(yǎng)150 d時不同甘露醇濃度處理對Da 70的影響

圖5 培養(yǎng)150 d時不同山梨醇濃度處理對Da 70的影響

3 討 論

本研究中，10 g·L-1、20 g·L-1蔗糖濃度處理能夠有效延緩植株生長，而高濃度蔗糖處理不利于參薯中期保存，這與山藥研究結(jié)果相似，在0.5%和1%蔗糖處理時幼苗生長顯著減緩[12]。但與馬鈴薯研究結(jié)果不同，10%蔗糖高濃度可延長馬鈴薯保存時間有效抑制其生長，且存活率達90%以上[13]。高濃度的蔗糖在參薯中并未起到滲透壓調(diào)節(jié)的作用。隨著蔗糖濃度的增加，反而促進參薯的快速生長，在高濃度(70 g·L-1)蔗糖處理下，依舊沒有抑制參薯試管苗的生長，這將有助于提高參薯的生物量。今后可以繼續(xù)加大蔗糖使用量來研究其對參薯限制生長的高濃度臨界值。

30 g·L-1和40 g·L-1甘露醇處理均能有效延緩植株生長，且促進參薯不定芽的分化。而在存活率上，40 g·L-1的處理顯著低于30 g·L-1的處理。在Villaluz等[11]的研究中，描述了在甘露醇處理下參薯試管苗根長和芽分化的狀態(tài)，并表明4%甘露醇處理能有效抑制參薯的生長，且在恢復(fù)后的盆栽試驗中發(fā)現(xiàn)，4%甘露醇處理和正常生長的參薯塊莖產(chǎn)量相當，但并未詳細描述高濃度甘露醇處理的試管苗具體的生長狀態(tài)及存活率。Sanghamitr等[12]的研究表明，山藥隨著甘露醇濃度從0增加至5%，植株生長受限，且葉片形態(tài)異常，并分化出許多不定芽，這與李潤等[14]研究的不同甘露醇濃度對馬鈴薯離體保存的影響結(jié)果一致。

高濃度山梨醇溶液處理并不能延緩參薯植株生長，在Villaluz等[11]的研究中，7%山梨醇溶液處理能夠有效減緩參薯植株生長，但是4%山梨醇溶液處理并未延緩植株生長。因此，今后可以繼續(xù)加大山梨醇的使用量來研究其對參薯限制生長的影響。

限制生長保存主要有降低溫度、調(diào)整培養(yǎng)基養(yǎng)分、調(diào)節(jié)滲透壓以及添加生長調(diào)節(jié)劑等方法，降低細胞的生長速度但不會造成死亡，以此達到保存種質(zhì)資源的目的，延長繼代的時間[15]。結(jié)果表明，除山梨醇外，降低蔗糖濃度和添加甘露醇均能有效的延長試管苗繼代時間，并且植株高度也顯著降低。目前，參薯試管苗中期保存統(tǒng)計時間為5個月，保存時間相對較短，有待進一步觀察保存更長時間的生長抑制情況。限制生長保存的研究除了添加高滲物質(zhì)外，還可在培養(yǎng)基中添加比久、多效唑、脫落酸、嘧啶醇等生長抑制劑。添加生長抑制劑的研究報道主要集中在馬鈴薯[7]、木薯[16]、芋頭[17]等物種上，尚未見有關(guān)參薯的國內(nèi)外研究報道，今后可以使用生長抑制劑研究中長期保存。