蔣小剛， 王 華， 周武先， 張美德

(湖北省農(nóng)業(yè)科學院中藥材研究所， 湖北 恩施 445000)

白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)為菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物，原產(chǎn)地為浙江、安徽，現(xiàn)已在浙江、安徽、河北、湖南、湖北等地普遍種植[1]，白術(shù)以根莖入藥，揮發(fā)油是主要藥效成分，其中含有蒼術(shù)醇、蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯等藥用成分[2-4]，具有健脾益氣，燥濕利水，止汗安胎的功效[5]。

白術(shù)栽培歷史悠久，長期不同產(chǎn)區(qū)及居群的引種和雜交現(xiàn)象導致白術(shù)出現(xiàn)種質(zhì)混雜、市場藥材質(zhì)量參差不齊等問題[6]，因此研究白術(shù)的遺傳多樣性和親緣關(guān)系對白術(shù)種質(zhì)鑒定、分類和良種選育至關(guān)重要。已有學者開展了對不同產(chǎn)區(qū)的白術(shù)的遺傳多樣性研究，孫靚等[6]采用ISSR分子標記技術(shù)對浙江、安徽、河北、山西四個省白術(shù)主產(chǎn)區(qū)的的15個居群進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)白術(shù)具有較高的遺傳多樣性，不同居群白術(shù)親緣關(guān)系與產(chǎn)區(qū)無明顯相關(guān)性。而劉逸慧等[7]的研究結(jié)果卻不同，通過對浙江、貴州、福建、湖北4個省白術(shù)主產(chǎn)區(qū)的7個居群的ISSR遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)同一主產(chǎn)區(qū)不同居群親緣關(guān)系相近，不同產(chǎn)區(qū)白術(shù)存在遺傳分化現(xiàn)象。雷美艷等[8]首次通過ITS2條形碼技術(shù)分析了安徽、浙江、重慶、河南、湖北等7個不同產(chǎn)地白術(shù)的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)地白術(shù)具有多種單倍型，且具有特異單倍型。也有學者對單一產(chǎn)區(qū)的不同品系白術(shù)進行遺傳多樣性分析。鄭建樹等[9]通過對大盤山自然保護區(qū)的11個白術(shù)品系進行ISSR聚類分析，結(jié)果表明，各品系之問都發(fā)生了遺傳分化，形成了遺傳差異，這將為白術(shù)優(yōu)良品系篩選奠定基礎(chǔ)。

本研究采用ISSR分子標記技術(shù)對浙江、安徽、河北、湖北、湖南、重慶等6個白術(shù)主產(chǎn)區(qū)的17份種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，探討不同產(chǎn)地白術(shù)的遺傳多樣性及遺傳分化水平，將為白術(shù)種質(zhì)資源鑒定、保存利用、良種選育等提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來源于白術(shù)種質(zhì)資源圃，每個產(chǎn)地隨機選取3株白術(shù)的幼嫩葉片混成1份樣品，共采集17份樣品，產(chǎn)地信息見表1。

表1 17份白術(shù)種質(zhì)的產(chǎn)地信息

1.2 基因組DNA提取及檢測

采用北京天根生物科技有限公司的新型植物DNA提取試劑盒提取白術(shù)幼嫩葉片基因組DNA，用超微量核酸蛋白測定儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ISSR多態(tài)性引物篩選及擴增

ISSR引物由上海英俊公司合成，選取B 1(重慶酉陽)和B 8(河北安國縣-2)兩個白術(shù)產(chǎn)地的模板DNA，基于優(yōu)化的白術(shù)ISSR反應(yīng)體系篩選出9條多態(tài)性ISSR引物，優(yōu)化的ISSR擴增體系為：模板DNA 1 μL(50 ng)，2×Taqmaster mix 10 μL，引物2 μL(5 μmoL)，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃ 預變性5 min，然后94 ℃變性0.75 min，52 ℃退火0.75 min，72 ℃延伸1.5 min，共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在瓊脂糖凝膠電泳膠圖上同一水平位置的有條帶記為1，無條帶記為0，采用Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進行整理，采用Popgene 1.32軟件計算遺傳特征指標：觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s 基因多樣性指數(shù)(He)和Shannon’s信息指數(shù)(I)，用NTSYS-pc 2.10軟件計算遺傳相似系數(shù)(GS)、遺傳距離(GD)，并用非加權(quán)組平均法(UPGMA)進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取與檢測

由圖1可知，提取的17份白術(shù)基因組DNA條帶清晰明亮、無拖尾。用中藥材條形碼ITS2對提取的白術(shù)基因組DNA進行擴增，結(jié)果表明，17份白術(shù)基因組DNA都能擴增出500 bp左右的片段，且條帶明亮單一(圖2)，表明提取的白術(shù)基因組DNA質(zhì)量高，可用于后續(xù)白術(shù)的ISSR分析。

2.2 ISSR引物擴增多態(tài)性

基于優(yōu)化的白術(shù)ISSR-PCR體系，從100條ISSR引物中篩選出9條多態(tài)性引物用于白術(shù)遺傳多樣性分析。由表2可知，9條引物擴增總條帶數(shù)為768，其中多態(tài)性條帶數(shù)為545，平均多態(tài)性條帶百分率為72%；擴增總位點數(shù)為73，其中多態(tài)性位點數(shù)為59，平均多態(tài)性位點百分率為88%。各引物多態(tài)性位點百分率都在50%以上，其中引物UBC 834、UBC 841、UBC 846的多態(tài)性位點百分率最高，均為100%。引物UBC 846多態(tài)性條帶數(shù)和多態(tài)性位點數(shù)都最多，分別為113和12，圖3電泳結(jié)果顯示，引物UBC 846對17份白術(shù)種質(zhì)擴增條帶差異明顯、條帶清晰，表明篩選的多態(tài)性引物適用于白術(shù)遺傳多樣性分析，以上結(jié)果表明，17份白術(shù)種質(zhì)資源具有豐富的遺傳信息。

表2 多態(tài)性ISSR引物擴增結(jié)果

注： M為DL 2000 DNA Marker；1～17為17份白術(shù)種質(zhì)編號。

注：M為SuperDNA Marker；1～17為17份白術(shù)種質(zhì)編號。

2.3 遺傳特性分析

用Popgene 1.32軟件對17份白術(shù)種質(zhì)進行遺傳特性分析。結(jié)果表明，白術(shù)種質(zhì)的平均等位基因(Na)為1.808 2，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.401 1，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)(He)為0.246 9，平均Shannon信息指數(shù)(I)為0.380 8，表明17份白術(shù)種質(zhì)遺傳多樣性水平較高。

2.4 遺傳相似性和遺傳距離分析

采用NTSYS-pc 2.10軟件分析17份白術(shù)種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)(GS)和遺傳距離(GD)。由表3可知，各種質(zhì)間GS值在0.589～0.904之間，平均值為0.727，變幅為0.315；各種質(zhì)間GD值在0.084～0.425之間，平均值為0.245，變幅為0.341。其中種質(zhì)B 3和B 17間的GS最大，而GD值最小，分別為0.904和0.084，表明B 3和B 17種質(zhì)間的遺傳相似性最高，親緣關(guān)系最近；B 5和B 14間的GS最小，而GD值最大，分別為0.589和0.425，表明B 5和B 14種質(zhì)間的遺傳相似性最低，親緣關(guān)系最遠。

2.5 聚類分析

采用NTSYS-pc 2.10軟件UPGMA聚類法對17份白術(shù)種質(zhì)資源進行系統(tǒng)聚類(圖4)，遺傳系數(shù)范圍為0.67～0.90，平均值為0.73，從上至下可將白術(shù)種質(zhì)聚類為四組，第一組為B 1，第二組可分為兩個亞組，第一亞組包括B 2、B 3、B 17、B 13、B 16，第二亞組包括B 6、B 7、B 10、B 11，第三組為B 4，第四組包括B 9、B 14、B 15，種質(zhì)B 12、B 5、B 8分別聚為一組。以上結(jié)果表明各產(chǎn)地白術(shù)存在明顯遺傳分化，具有豐富的遺傳多樣性。

3 討 論

研究不同產(chǎn)地白術(shù)的遺傳多樣性對于白術(shù)種質(zhì)資源鑒定分類、保護利用、良種選育等具有重要參考價值。ISSR分子標記是基于微衛(wèi)星序列開發(fā)出的新型分子標記，相比傳統(tǒng)的分子標記，具有多態(tài)性豐富、標記數(shù)量多、易檢測、成本低等優(yōu)勢[10-11]，已廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定、指紋圖譜、基因定位、系統(tǒng)進化等方面研究[12-13]。

表3 17份白術(shù)種質(zhì)遺傳相似系數(shù)和遺傳距離

注：M為DL 2000 DNA Marker；1～17為17份白術(shù)種質(zhì)編號。

本研究基于篩選的9條多態(tài)性ISSR引物從17份白術(shù)資源的基因組DNA中擴增出768條條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)為545，平均多態(tài)性條帶百分率為72%。此外，遺傳特征指標如平均Nei’s基因多樣性指數(shù)(He)為0.246 9，平均Shannon信息指數(shù)(I)為0.380 8，表明白術(shù)的遺傳多樣性水平較高，這與孫靚等[6]的研究結(jié)果一致。種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系是種質(zhì)創(chuàng)新利用和優(yōu)良品種選育的基礎(chǔ)[12]。遺傳相似性(GS)和遺傳距離(GD)分析發(fā)現(xiàn)，B 3(湖南省平江縣-2)和B 17(浙術(shù)1號)種質(zhì)間的遺傳相似性最高，親緣關(guān)系最近，浙術(shù)1號為選育的白術(shù)優(yōu)良品種[14]，可見B 3種質(zhì)在遺傳特性上與浙術(shù)1號最為相似，這為B 3產(chǎn)地的優(yōu)良品種選育提供依據(jù)。系統(tǒng)聚類發(fā)現(xiàn)，B 2(湖南省平江縣)和B 3(湖南省平江縣-2)，B 7(河北省安國縣)和B 10(河北省安國縣-4)，B 14(浙江省新昌縣回山鄉(xiāng))和B 15(浙江省嵊州市谷來鎮(zhèn))分別聚為一類，表明地理分布與親緣關(guān)系具有一定相關(guān)性[15]，而部分地理分布較近的產(chǎn)地卻沒有聚在一起，比如安徽省亳州市譙城區(qū)的3個產(chǎn)地B 11、B 12和B 13并未聚為一類，而是分散在各聚類組中，表明部分產(chǎn)地白術(shù)沒有產(chǎn)生明顯的地域性差異，這與孫靚等[6]的研究結(jié)果一致。此外，B 1(重慶市酉陽縣)、B 12(安徽省亳州市譙城區(qū)-2)、B 5(湖北省咸豐縣小村鄉(xiāng))、B 8(河北省安國縣-2)分別聚為一組，可見白術(shù)資源遺傳差異較大，遺傳信息豐富，這將為白術(shù)優(yōu)勢單株篩選，雜交親本選配及進一步的良種選育提供一定基礎(chǔ)。

注：B 1～B 17種質(zhì)編號見表1。

本研究對17份不同產(chǎn)地的白術(shù)種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性分析，在分子水平上可為白術(shù)種質(zhì)資源分類提供參考，同時為白術(shù)新品種選育提供科學依據(jù)。