趙 欣，習(xí)丙文，2，張鳳翔

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫 214128；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇 無錫 214081；3.興化市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，江蘇 興化 225700)

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗稱河蟹，是我國重要的特色淡水養(yǎng)殖品種之一。國內(nèi)河蟹養(yǎng)殖業(yè)從20世紀(jì)80年代開始快速發(fā)展，在一些地區(qū)已成為標(biāo)志性養(yǎng)殖水生動物。隨著養(yǎng)殖的不斷發(fā)展，病害成為困擾河蟹健康養(yǎng)殖的重要問題。近年來，江蘇鹽城、興化以及周邊等河蟹養(yǎng)殖區(qū)出現(xiàn)大量死亡情況。病蟹外表正?；虬l(fā)黃，肥滿度和活力下降、少食甚至不進(jìn)食，隨著病情的逐漸加重，肝胰腺由金黃色逐漸變成淺黃，最終為灰白色，胸腔有積液等情況(陸宏達(dá)等，2017；宋學(xué)宏等，2007)。根據(jù)這些臨床癥狀，該類疾病被稱為中華絨螯蟹肝胰腺壞死綜合征(Hepatopancreatic necrosis syndrome，HPNS)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)多種原因均可造成中華絨螯蟹肝胰腺發(fā)生病變壞死，并且有研究表明HPNS 可能與微孢子蟲感染有關(guān)(趙彥華等，2017)。

本文以河蟹為研究對象，通過對江蘇省不同地區(qū)河蟹調(diào)查采樣，研究壞死肝胰腺的組織病理變化，檢測了壞死和正常河蟹肝胰腺的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(G-PX)活性及丙二醛(MDA)、糖原含量，同時，進(jìn)一步探究肝胰腺壞死是否與孢子蟲感染有關(guān)。研究結(jié)果將對揭示該病的病因和確定有效的預(yù)防措施等方面提供一定的理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)材料

在江蘇省范圍廣泛調(diào)查和采集河蟹。中華絨螯蟹于2017 年6－9 月從江蘇省的南通、常州前黃、南京溧水、興化安豐、鹽城大豐5個地區(qū)進(jìn)行樣品采集。采集的肝胰腺樣品首先在0.67%的生理鹽水中沖洗干凈，部分樣品保存于4%福爾馬林中，用于形態(tài)觀察；同時保存一部分樣品于液氮中用于分子生物學(xué)分析和生化指標(biāo)測定。

2.試驗(yàn)方法

(1)河蟹肝胰腺組織病理觀察。首先解剖觀察河蟹肝胰腺是否有變化，將采集的肝胰腺樣品用4%福爾馬林固定，經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋，切片厚度為5微米，蘇木精—伊紅(H.E)染色，顯微鏡下觀察、拍照，對采集自江蘇省不同地區(qū)的河蟹肝胰腺分別進(jìn)行組織病理分析。

(2)河蟹肝胰腺生化指標(biāo)測定。從液氮中取健康與病變蟹肝胰腺各0.1 克，與預(yù)冷的生理鹽水(0.67%氯化鈉溶液)按1∶9(M/V)混合后冰浴勻漿制成10%勻漿液，然后于4℃、4 000 轉(zhuǎn)/分條件下離心10 分鐘，取上清液。采用南京建成生物公司所研發(fā)的試劑盒來測定SOD、CAT、G-PX 的活性和MDA、糖原的含量。

(3)河蟹肝孢蟲檢測。將各個地區(qū)的樣品用試劑盒提取總基因組DNA，根據(jù)文獻(xiàn)中的特異引物，采用的PCR 檢測方法：上游引物為MF1：5'-CCGGAGAGGGAGCCTGAGA-3'，下游引物為MR1：5'-GACGGGCGGTGTGTACAAA-3'，以被提取的樣本DNA 為模板，以MF1、MR1 為正向和反向引物進(jìn)行片段擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為引物MF1(10 毫摩)1 微升、引物MF2(10 毫摩)1 微升、EX 10×Buffer 2 微升、dNTPs(2.5 毫 摩)4 微 升、EX TaqDNA 聚 合 酶(5 單位/微升)0.2 微升、模板DNA 2 微升、去離子水15 微升。反應(yīng)條件為：95℃變性4 分鐘；接著35 個循環(huán)的95℃1 分鐘、58℃30 秒、72℃45 秒；最后是72℃延伸5 分鐘，4℃保存。在PCR 反應(yīng)結(jié)束后，在1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察，若樣品在931 bp 處出現(xiàn)條帶，即可判定為陽性。

3.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，對病變蟹和健康蟹數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著，P＞0.05 為差異不顯著。健康蟹和病變蟹的所有測定數(shù)據(jù)的樣本數(shù)n＝20，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

二、結(jié)果與分析

1.中華絨螯蟹臨床癥狀

作為對照采集的健康蟹活力高、攝食能力強(qiáng)、甲殼堅(jiān)硬、附肢肌肉結(jié)實(shí)、鰓絲正常光澤、肝胰腺飽滿呈金黃色。剛開始發(fā)病的蟹外表無明顯的異常、攝食能力逐漸減弱，隨著病情發(fā)展，蟹甲殼變軟發(fā)黃或發(fā)黑、附肢空殼且肌肉萎縮、附肢無力、反應(yīng)遲鈍、斷裂后便流出大量液體、鰓絲發(fā)黑萎縮；打開病蟹的頭胸甲，肝胰腺顏色逐漸變淡、肝胰腺量減少、胸腔中積液量增多，并且肝胰腺壞死現(xiàn)象多發(fā)于雄蟹。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，肝胰腺顏色隨著病蟹發(fā)病程度加重而有規(guī)律地變化，肝胰腺由金黃色變?yōu)闇\黃色，最后萎縮為灰白色，一般少食或停止進(jìn)食，嚴(yán)重消瘦。由于蟹的可食部分肝胰腺糜爛萎縮，肌肉大量減少，使蟹失去食用價值，從而降低經(jīng)濟(jì)價值。

2.河蟹肝胰腺組織病理分析

河蟹肝胰腺由許多分枝肝小管組成，肝小管由基膜和4 種肝胰腺細(xì)胞(泡狀細(xì)胞、吸收細(xì)胞、纖維細(xì)胞、胚細(xì)胞)構(gòu)成。細(xì)胞核整齊排列，細(xì)胞間界線清楚，基膜完整沒有褶皺。中華絨螯蟹在發(fā)病初期肝胰腺為淡黃色，基膜微微皺縮，接著肝細(xì)胞大部分萎縮、變形。細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間界線逐漸消失，部分壞死細(xì)胞脫落至肝小管管腔內(nèi)，基底膜變形，部分破裂解體。肝胰腺細(xì)胞與基膜分離，出現(xiàn)空隙，肝小管嚴(yán)重破損，整個肝胰腺呈糨糊狀，后期萎縮成灰白色(圖1)。

圖1 肝胰腺組織病理

3.河蟹肝胰腺生化指標(biāo)分析

正常蟹與病變蟹生化指標(biāo)見表1。由表1 結(jié)果可知，壞死肝胰腺總蛋白質(zhì)含量極顯著低于正常肝胰腺組(P＜0.01)；壞死肝胰腺的SOD、CAT、GPX的活力均有不同程度的降低，而MDA的含量表現(xiàn)為一定程度的升高。其中，壞死肝胰腺SOD 和CAT的活力顯著低于正常肝胰腺組(P＜0.05)，而壞死肝胰腺G-PX 的活力極顯著低于正常肝胰腺組(P＜0.01)，壞死肝胰腺M(fèi)DA 的含量極顯著高于正常肝胰腺組(P＜0.01)；壞死肝胰腺糖原含量極顯著低于正常肝胰腺組(P＜0.01)。

表1 正常蟹與病變蟹生化指標(biāo)比較

4.河蟹肝孢蟲感染情況調(diào)查

微孢子蟲調(diào)查地區(qū)具體采集位置分別為南通、常州前黃、南京溧水、興化安豐及鹽城，在調(diào)查江蘇省的5個地區(qū)中，共隨機(jī)抽取中華絨螯蟹85 只，其中有14 只感染微孢子蟲，陽性率為16.5%，其中常州前黃的樣品感染率最高，其次為南通和興化安豐，具體感染情況見表2。

表2 江蘇地區(qū)河蟹肝孢蟲感染情況

三、討論

1.組織病理和理化指標(biāo)變化分析

肝胰腺是甲殼類動物最重要的消化免疫器官，同時也是中華絨螯蟹最重要的營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和儲存器官?；疾『有返母我认俨∽兪謬?yán)重，大部分細(xì)胞萎縮、變形，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間的界限模糊，上皮細(xì)胞與基膜分離，出現(xiàn)空隙，這與陸宏達(dá)等(2017)描述的中華絨螯蟹水癟子病不同發(fā)病階段的病理變化特點(diǎn)相一致。由于這些病變破壞了細(xì)胞功能，從而導(dǎo)致肝胰腺物質(zhì)和能量吸收、儲備和代謝等主要生理功能紊亂，最終影響到整個機(jī)體的新陳代謝(成永旭等，2000)。

本研究顯示，壞死肝胰腺中SOD、CAT、G-PX活力降低，由于河蟹患病后代謝過程中產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致清除自由基酶的損耗，也就出現(xiàn)SOD、CAT、G-PX 酶活力降低的現(xiàn)象；接著脂質(zhì)過氧化，從而引起MDA 含量升高，繼而損傷肝細(xì)胞，最終引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞、肝胰腺功能異常。由于肝細(xì)胞的損傷，肝胰腺物質(zhì)合成、消化吸收功能紊亂，會造成患病河蟹食欲下降或者不吃食；而能量代謝功能紊亂，直接影響到能量供應(yīng)；由于攝食量減少或停止攝食，機(jī)體能量不足，肝胰腺中的糖原分解供能，因此，壞死肝胰腺中的糖原含量顯著低于正常肝胰腺。

2.河蟹肝孢蟲感染情況調(diào)查分析

本次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，一些具有典型肝胰腺壞死綜合征的河蟹在進(jìn)行河蟹肝孢蟲檢測時出現(xiàn)陰性信號，而未有該癥狀的河蟹卻檢測出河蟹肝孢蟲，因此初步認(rèn)為河蟹肝孢蟲并不是導(dǎo)致河蟹肝胰腺壞死綜合征的病原。同時結(jié)果顯示江蘇省河蟹肝孢蟲感染情況偶有發(fā)生，但是相比于趙彥華等(2017)報道河蟹肝孢蟲感染率略低。有研究表明養(yǎng)殖水域環(huán)境對河蟹肝孢蟲感染有重要影響(Ding Z 等，2016)。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，感染河蟹肝孢蟲的蟹池養(yǎng)殖環(huán)境較差，蟹池中水草生長過密、水體渾濁、水質(zhì)較差，會引起并加劇河蟹的脅迫反應(yīng)，從而大大提高河蟹肝孢蟲感染率。

目前，關(guān)于水產(chǎn)動物病害的研究存在一病多癥、一癥多病、同名異病和同病異名等問題，并且寄生蟲性疾病、病毒性疾病、細(xì)菌性疾病均可造成中華絨螯蟹肝胰腺病變壞死。因此河蟹肝孢蟲能否確定為中華絨螯蟹肝胰腺壞死綜合征的病原，還需要進(jìn)一步的研究。