王群，劉潔，趙道松，方小雪

(寧波微萌種業(yè)有限公司，浙江 寧波 315100)

青梗菜(BrassicarapaSSP.Chinensis)為十字花科、蕓薹屬作物，起源于中國。青梗菜生長周期短，適應性廣，可以隨時播種、持續(xù)采收，對于克服春、冬季蔬菜淡季供應不足，保證蔬菜均衡供應，調(diào)節(jié)市場供應起著重要作用。近年來，隨著青梗菜栽培面積擴大和國內(nèi)市場對優(yōu)質(zhì)青梗菜品質(zhì)需求的提升，青梗菜常規(guī)品種因整齊度差、退化等問題漸漸被淘汰，而青梗菜雜交品種因整齊度高、抗病性強、商品性好等優(yōu)勢越來越受人們喜歡。

隨著市場對優(yōu)質(zhì)青梗菜雜交種的需求量增加，青梗菜雜交種的質(zhì)量問題逐漸引起人們關注。在青梗菜雜交種制種過程中常因混有親本自交系種子或其他品種種子等生物學混雜問題影響種子純度，因此，對青梗菜雜交種進行純度鑒定是保證雜交種質(zhì)量的必要步驟之一。目前我國青梗菜純度鑒定主要以田間表型鑒定為主，此方法簡單、直觀，但受環(huán)境差異影響大、鑒定周期長且費工占地、表型特征判斷不易把握[1]，因此，建立青梗菜雜交種純度室內(nèi)快速鑒定方法十分必要。

隨著分子標記技術的發(fā)展，SSR分子標記被廣泛應用于蔬菜種子純度鑒定工作中，前人利用SSR分子標記技術完成黃瓜、甜瓜、辣椒等作物的純度鑒定[2-4]。SSR標記在十字花科作物中也得到應用，如青梗菜速俊109雜交種純度SSR分子標記鑒定[5]。但用于純度鑒定的SSR標記需從大量的引物庫中進行篩選，耗時耗力，因此，需要一種更高效、準確的分子標記技術。近幾年隨著全基因組測序技術的發(fā)展，InDel標記也被成功應用于結球甘藍、大白菜等十字花科蔬菜作物的純度檢測[6-8]。

本實驗通過對青梗菜15039的親本(W1、W2)進行全基因組重測序和數(shù)據(jù)分析，開發(fā)出可用于青梗菜15039純度鑒定的InDel分子標記，為以后開展青梗菜大規(guī)模、高效的室內(nèi)純度鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料青梗菜15039(正交組合152株、反交組合152株)及其親本(W1、W2)種子由寧波微萌種業(yè)有限公司(以下簡稱微萌種業(yè))提供，均種植于微萌種業(yè)育種基地。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

隨機選取青梗菜15039及其父、母本植株各10株，用打孔器分別在青梗菜15039及其父、母本植株的嫩葉上取樣，分別以青梗菜15039及其父、母本的嫩葉混合樣品為材料提取DNA，獲得青梗菜15039及其父本、母本的混合基因池。

青梗菜15039(正交組合152株、反交組合152株)植株葉片采用CTAB法進行單株DNA提取，用于純度檢測。

1.2.2 全基因組重測序及InDel位點篩選

父、母本混合基因池送到天津諾禾致源生物信息科技有限公司進行全基因組重測序，利用UltraEdit和Excel軟件進行測序數(shù)據(jù)的對比和分析。

1.2.3 引物設計

重測序基因序列與白菜全基因組數(shù)據(jù)(Bra_Chromosome_V3.0)進行對比，得到raw date，數(shù)據(jù)過濾后對比篩選得到具有InDel差異的有效數(shù)據(jù)。從BRAD數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org/brad/blastPage.php)中下載白菜全基因組數(shù)據(jù)(Bra_Chromosome_V3.0)，用Primer Premier 5.0軟件在差異位點兩側(cè)保守區(qū)設計引物。為了確保擴增的特異性，引物設計參數(shù)特別考慮GC含量介于40%～50%、退火溫度介于50～60 ℃，引物片段長度介于17～25 bp。

1.2.4 PCR體系的構建

PCR擴增采用近岸蛋白質(zhì)科技有限公司的2×Taq Master Mix。

PCR體系為20 μL：DNA模板1 μL(DNA濃度50 ng·μg-1)，正反向引物各1 μL(引物濃度10 ng·μL-1)，2×Tap Master Mix 10 μL，超純水7 μL。

PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性20 s，54 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)32次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存1 h。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠檢測。

2 結果與分析

2.1 引物篩選

通過對青梗菜15039親本進行全基因組重測序數(shù)據(jù)分析設計出12對引物(表1)。12對引物對青梗菜15039及其父、母本的DNA擴增結果如圖1，根據(jù)電泳結果篩選出3對具有多態(tài)性的引物jpk-1、jpk-3和jpk-7。其中引物jpk-1和jpk-3雖滿足父、母本擴增存在差異及F1呈共顯性的引物篩選要求，但父、母本擴增的條帶片段差異較小，需電泳1.5 h后父、母本條帶才會出現(xiàn)明顯差異，耗時太長，因此，不選取這兩對引物用于純度鑒定。引物jpk-7母本擴增片段大小為225 bp，父本擴增片段大小為184 bp，父、母本擴增的條帶片段差異大，帶型清晰穩(wěn)定，可用于青梗菜15039純度鑒定。

M—maker；W1—母本；W2—父本；F1—雜交種15039；jpk-1～8—引物編號。

表1 12對InDel引物的序列

2.2 引物jpk-7檢測青梗菜15039植株純度

利用篩選出的引物jpk-7對田間種植的304株青梗菜15039(正交組合編號1～152，反交組合編號153～304)進行純度檢測，檢測純度率為96.05%。其中，正交組合(編號1～152)的152個單株中有9株母本植株，編號分別為57、86、91、102、111、123、131、143和150，其余143株都為雜交種，編號47～92單株擴增結果如圖2所示，編號57、86和91植株只擴增出母本條帶，缺少父本條帶；反交組合(編號153～304)的152個單株中有3株父本植株，編號分別為188、218和279，其余149株都為雜交種，編號183～228單株擴增結果如圖3所示，編號188和218號只擴增出父本條帶，缺少母本條帶。

M—maker；W1—母本；W2—父本；57、86、91—青梗菜15039母本。

M—maker；W1—母本；W2—父本；188、218—青梗菜15039父本。

2.3 田間表型鑒定青梗菜15039植株純度

304株青梗菜15039植株(正交組合編號1～152，反交組合編號153～304)定植后20 d開始觀察記錄植株田間表型性狀，2～3 d觀察一次，共觀察5次。青梗菜15039母本植株與F1田間表型區(qū)別為株型較矮，葉脈紋路更明顯，葉色淺綠無光澤；青梗菜15039父本植株與F1田間表型區(qū)別為株型較開展，葉片較小。經(jīng)過田間表型鑒定，304株青梗菜15039植株純度率為96.71%。其中正交組合(編號1～152)的152個單株中有7株母本植株，編號分別為57、86、91、102、123、143、150，其余145株認定為雜交種；反交組合(編號153～304)的152個單株中有3株父本植株，編號分別為188、218、279，其余149株認定為雜交種。

2.4 InDel標記檢測與田間表型鑒定純度結果對比

InDel標記檢測與田間表型鑒定純度結果如表2，InDel標記檢測304株青梗菜15039中有12株親本株，純度率為96.05%；田間鑒定304株青梗菜15039中有10株親本株，純度率為96.71%。青梗菜15039反交組合的152個單株InDel標記檢測結果與田間表型鑒定結果完全一致。青梗菜15039正交組合的152個單株InDel標記檢測結果與田間表型觀察鑒定結果基本相符，存在較小差異，田間表型觀察結果為親本的7個單株同時也全部被InDel標記檢測為親本，而編號111和131的植株田間表型鑒定結果為雜交種，但InDel標記檢測為親本。

表2 InDel標記與田間表型觀察鑒定純度結果的比較

3 小結與結論

近年來，SSR分子標記因引物廣譜性、操作簡單、成本低等特點，已經(jīng)在水稻、油菜、玉米、小麥、西瓜、甜瓜、棉花等作物的種子純度鑒定中得到廣泛應用[9]。但隨著全基因組測序技術的發(fā)展，InDel標記也逐漸進入大家視野并已成功應用于玉米、瓠瓜、大白菜等蔬菜作物中。InDel標記與SSR標記相比具有數(shù)量更豐富、穩(wěn)定性和重復性更好、擴增產(chǎn)物分離效果更顯著等優(yōu)點[10]。并且針對檢測材料設計的引物具有更高準確性，可以大大節(jié)省引物篩選時間，因此，會越來越受育種者關注。

本試驗從12對InDel引物中篩選出3對具有雙親互補型的引物，選用其中1對條帶差異大、穩(wěn)定性高的InDel引物對青梗菜15039雜交種進行純度鑒定。這對引物對304株青梗菜15039植株純度檢測結果與田間表型鑒定結果存在較小差異，檢測結果相同的有302株，檢測結果不相同的有2株，兩者結果相同比例高達99.34%，因此，引物jpk-7可以應用于青梗菜15039植株純度檢測。

本試驗為今后應用InDel標記檢測青梗菜純度積累了一定經(jīng)驗。首先，在進行分子檢測結果與田間表型鑒定結果比對時，需在植株不同生長期對植株田間表型進行多次鑒定，以保證田間表型鑒定純度結果的準確性。其次，考慮到分子標記純度鑒定需要高通量快速進行，因此，篩選引物時需要綜合考量引物的質(zhì)量好、穩(wěn)定性高與耗時短等因素。