黎劭學肖曉嵐尹 雷孟苗苗岑學程蔡 軍杭春華

(1.廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 腦病中心,廣州 510120； 2.廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 兒科,廣州 510120； 3.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院,廣州 510120； 4.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院 神經(jīng)外科,南京 210008)

動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是一種致死致殘率甚高的腦血管危急重癥[1]。 SAH 后早期腦組織損傷(early brain injury, EBI)覆蓋了從初次出血到血管痙攣發(fā)生前72 h 內(nèi),腦組織的一系列重要病理損傷改變,是導致SAH 高致殘致死率的主要機制[2-4]。 而氧化損傷導致的神經(jīng)細胞凋亡是其中的一個重要環(huán)節(jié)。

核因子相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是參與調(diào)節(jié)細胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子[5]。 在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,Nrf2 會激活并啟動下游的基因轉(zhuǎn)錄,通過上調(diào)多種抗氧化酶的表達,以提高細胞的抗氧化能力[6]。 梔子苷(geniposide, GNP)屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物,是茜草科植物山梔(Gardenia jasminoidesEllis)果實中的其中一種主要活性成分。 GNP 的藥理作用相當廣泛,具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)血糖、抗腫瘤等多種功效[7-11]。 近年研究發(fā)現(xiàn),GNP 在缺血及出血性腦血管病細胞及動物實驗模型中,均表現(xiàn)出一定的神經(jīng)保護作用,但其相關(guān)作用通路及分子機制尚不完全明確,可能與抗氧化應(yīng)激、抗炎、線粒體保護等多個機制存在密切關(guān)系[12-13]。 有關(guān)GNP 對SAH后EBI 的作用鮮有研究,為了探討相關(guān)機制,本研究對大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型進行GNP 后處理,通過觀察Nrf2 通路相關(guān)抗氧化損傷蛋白表達的變化及神經(jīng)細胞凋亡情況探討其可能的治療效果。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

60 只SPF 級雄性Wistar 大鼠,12 ～13 周齡,重量約280 ～330 g,由揚州大學比較醫(yī)學中心提供[SCXK(蘇)2017-0007],飼養(yǎng)于南京市鼓樓醫(yī)院動物實驗中心[SYXK(蘇)2018-0020]。 飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(22±2)℃,具有12 h 光照循環(huán),動物自由飲食。 本實驗經(jīng)南京市鼓樓醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批(IACUC 2018020003),并在實驗過程中嚴格遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

梔子苷(購自上海源葉生物科技有限公司,HPLC ≥9899.3%,貨號:24512-63-8)；戊二醛(MDA)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所,A003-1)；Nrf2 抗體(批號AF7603)、NQO-1 抗體(批號AF7614)、HO-1 抗體(批號AF1333)、GST 抗體(批號AF2299)、GAPDH 抗體(批號AF5009)、TUNEL 試劑盒(批號C1089)購自碧云天生物科技有限公司。

5024R 低溫高速離心機(德國eppendorf 公司)；FLX800 熒光酶標儀(美國BioTek 公司)；IX51 熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)；XO-400S 超聲波細胞破碎儀(中國南京先歐公司)；Western blot 轉(zhuǎn)印電泳儀器(美國Bio-Rad 公司)；Tanon5200 化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(中國上海天能科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及給藥方法

Wister 大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后,隨機分為4組:假手術(shù)組、模型組,GNP 低劑量組(50 mg/kg),GNP 高劑量組(100 mg/kg),每組12 只。 藥物處理的兩組大鼠在造模后30 min 給予GNP 不同劑量一次腹腔內(nèi)注射處理。 模型組和假手術(shù)組以等量生理鹽水代替藥物注入。

1.3.2 大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型制作

本研究選用視交叉前池注血模型,操作步驟與在既往報道上進一步改進[14]:取俯臥位,將動物固定顱頂水平位,于冠狀縫前8.0 mm 處鉆孔。 解剖右側(cè)股動脈并抽取自體動脈血350 μL。 立即將注射器以30°方向,插入穿刺孔10 mm,即達視交叉前池,維持20 s 將自體血注射完畢。 骨蠟封閉骨孔縫合頭皮,頭低位30 min,飼養(yǎng)同術(shù)前。 在建模過程中,如大鼠造模失敗或24 h 內(nèi)死亡,則取用備用大鼠補齊每組存活12 只。 假手術(shù)組接受相同的SAH造模流程,但視交叉前池僅注入相應(yīng)等量的生理鹽水,其它步驟不變。

1.3.3 腦組織取材及處理

在造模后第24 h 處死大鼠,分別以冰凍生理鹽水灌注后取全腦并根據(jù)Sugawara 評分標準[15]進行蛛網(wǎng)膜下腔出血評分(圖1)。 其后取顳葉皮層進行MDA 含量測定及Western blot 實驗操作。 另用生理鹽水灌注后再使用多聚甲醛灌注固定并制石蠟切片,備免疫熒光法檢測Nrf2 的細胞表達情況,以及TUNEL 熒光染色觀察細胞凋亡情況。

1.3.4 免疫熒光標記染色檢測顳葉皮層Nrf2 表達情況

石蠟切片脫蠟、熱修復,加入3% H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶。 加入兔抗Nrf2(1 ∶200)4℃孵育過夜,加入熒光二抗37℃孵育90 min。 復染后在熒光顯微鏡下觀察陽性表達情況。

1.3.5 顳葉皮層組織MDA 含量測定

提取部分適量顳葉皮層組織,在冰浴中按照1 ∶9(W/V)加入生理鹽水制成10%腦組織勻漿,離心后取上清液,按照試劑盒說明進行操作測定MDA含量。

1.3.6 Western blot 檢測HO-1、NQO-1、GST 蛋白表達

提取顳葉皮層腦組織,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜后分別加稀釋的一抗NQO-1、HO-1、GST 及β-actin 4℃孵育過夜。 加二抗室溫孵育2 h,洗膜后顯影成像。 采用Quantity One 軟件分別計算各條帶灰度值的百分比,以分析各組蛋白表達量。

1.3.7 TUNEL 檢測神經(jīng)細胞凋亡情況

按照試劑盒說明步驟進行檢測,室溫下,PBS 溶液清洗、TrixonX-100 處理后,滴加TdT 酶熒光標記液避光孵育,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染液進行核染色,孵育并再次PBS 溶液清洗后,用抗熒光淬滅劑封片,熒光顯微鏡觀察并拍照。 隨機選取切片5 個區(qū)域,通過計數(shù)總細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù),計算細胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學分析軟件建立數(shù)據(jù)庫,數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差(±s)表示,對組間數(shù)據(jù)的比較統(tǒng)計采用單因素方差分析(Oneway ANOVA),組間行turkey檢驗,死亡率比較采用Fisher’s 精確概率檢驗,P＜0.05 認為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠死亡率及蛛網(wǎng)膜下腔出血情況評分

在造模后至處死前24 h 內(nèi),假手術(shù)組、模型組、GNP 低劑量組、GNP 高劑量組的死亡率及存活情況分別為0%(n=0/12)、20%(n=3/15)、20%(n=3/15)和7.7%(n=1/13)。 雖然GNP 高劑量組死亡率百分比較模型組及低劑量組有所下降,但各組間死亡率并無顯著統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

對于大鼠而言,24 h 后蛛網(wǎng)膜下腔出血即被迅速清除[16]。 本實驗根據(jù)Sugawara 評分標準[15],在24 h 觀察點對實驗大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血量進行評分,結(jié)果示假手術(shù)組的大鼠腦組織未見出血,評分為0 分。 而模型組、GNP 低劑量組、GNP 高劑量組在24 h 的腦組織腹側(cè)可見蛛網(wǎng)膜下腔不同程度的積血和血凝塊,如圖2 所示。 四組的SAH 出血量評分分別為0、(15.17±0.48)、(14.26±0.61)、(14.35±0.77)。 雖然藥物處理的兩組大鼠術(shù)后24 h SAH出血量明顯高于假手術(shù)組,但與模型組相比,評分并無顯著性差異(P＞0.05,n=6)。

2.2 GNP 對SAH 大鼠模型顳葉皮層Nrf2 表達的影響

注:(A):腹側(cè)6 分區(qū),6 個部位分數(shù)相加得出總的評分以評估大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血情況,最低分0 分,最高分18分。 0 分:未見出血；(B):中度蛛網(wǎng)膜下腔出血,1 分:極少量血凝塊；2 分:中等量蛛網(wǎng)膜下腔出血,但仍可看清血管；(C):重度蛛網(wǎng)膜下腔出血,3 分:大量出血,該部分血管難以辨認。圖1 蛛網(wǎng)膜下腔出血Sugawara 評分Note. (A), Six segments of the basal cistern. The subarachnoid blood clots are assessed in each of these segments to allot a score from 0 to 18. 0, No blood.(B), Moderate SAH. 1, Minimal subarachnoid blood. 2, Moderate blood clot with recognizable arteries. (C), Severe SAH. 3, Blood clot obliterating all arteries within the segment.Figure 1 Subarachnoid hemorrhage grading

注:A:假手術(shù)組；B:模型組；C:GNP 低劑量組；D:GNP 高劑量組。圖2 造模后24 h 實驗大鼠全腦蛛網(wǎng)膜下腔出血情況Note. A, Sham+vehicle group. B, SAH+vehicle group. C, SAH+GNP low dose group. D, SAH+GNP high dose group.Figure 2 The whole brain of SAH rat model at 24 h

免疫熒光標記染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠大顳葉皮層組織偶見微弱熒光染色,Nrf2 陽性百分率為(0.028 ± 0.031)%。 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠顳葉皮層Nrf2 陽性細胞數(shù)目略有增多,陽性百分率為(21.014 ± 1.828)%,兩者有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 與模型組相比,經(jīng)GNP 干預后Nrf2 陽性細胞數(shù)目進一步增加(P＜0.05),低劑量組為(47.750± 4.176)%,高劑量組的增加更為顯著,為(76.733± 2.949)%。 提示GNP 能促進SAH 后Nrf2 的激活(圖3)。

2.3 GNP 對SAH 大鼠模型顳葉皮層MDA 含量的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠顳葉皮層MDA含量顯著增高。 藥物干預組雖亦有升高,但較模型組有所降低(P＜0.05),且高劑量組升高較少。 提示GNP 能顯著減輕SAH 后由MDA 的升高,抑制細胞的氧化損傷(圖4)。

注:A:假手術(shù)組；B:模型組；C:GNP 低劑量組；D:GNP 高劑量組。圖3 GNP 對SAH 大鼠模型顳葉皮層Nrf2 表達的影響(n=6)Note. A,Sham+vehicle group. B,SAH+vehicle group. C, SAH+GNP low dose group. D,SAH+GNP high dose group.Figure 3 Effects of GNP on Nrf2 expression in the temporal cortex of the SAH rat model

2.4 GNP 對SAH 大鼠模型顳葉皮層HO-1、NQO-1、GST 蛋白表達的影響

與假手術(shù)組相比,模型組的HO-1、NQO-1、GST蛋白表達均有明顯升高(P＜0.05)。 與模型組相比,經(jīng)GNP 處理后HO-1、NQO-1、GST 蛋白的表達進一步增加(P＜0.05)。 提示GNP 能顯著增強SAH 后由Nrf2 誘導的下游抗氧化酶HO-1、NQO-1、GST 的表達,提高細胞的抗氧化能力(圖5)。

2.5 GNP 對SAH 大鼠模型顳葉皮層神經(jīng)細胞凋亡的影響

造模后24 h,模型組TUNEL 陽性細胞比例明顯上升,凋亡率為(50.88 ± 6.22)%,較假手術(shù)組(0.00 ± 0.02)%有顯著性差異(P＜0.05)。 而GNP處理的兩組TUNEL 陽性細胞比例較模型組明顯下降,且GNP 高劑量組細胞凋亡率為(28.76 ±7.37)%,低于GNP 低劑量組(39.86 ± 8.57)%(P＜0.05)。 提示高劑量GNP 能夠顯著改善SAH 造模后24 h 的神經(jīng)細胞凋亡(圖6)。

注:A:假手術(shù)組； B:模型組； C:GNP 低劑量組； D:GNP 高劑量組。 與模型組相比,*P＜0.05。圖4 GNP 對SAH 大鼠顳葉皮層丙二醛(MDA)含量的影響(n=6)Note. A,Sham+vehicle group. B,SAH+vehicle group. C,SAH+GNP low dose group. D, SAH+GNP high dose group. Compared with model group,*P＜0.05.Fig ure 4 Effects of GNP on malondialdehyde (MDA) contents in the temporal cortex of the SAH rat model

注: A:假手術(shù)組； B:模型組； C:GNP 低劑量組； D:GNP 高劑量組。 與模型組相比,*P＜0.05。圖5 SAH 大鼠模型顳葉皮層組織中HO-1、NQO-1、GST 蛋白表達的相對強度(n=6)Note. A, Sham+vehicle group. B, SAH+vehicle group. C, SAH+GNP low dose group. D, SAH+GNP high dose group.Compared with model group, *P＜0.05.Figure 5 Rrelative intensity of HO-1、NQO-1、GST protein expressions of temporal cortex of the SAH rat model

注: A:假手術(shù)組；B:模型組；C:GNP 低劑量組；D:GNP 高劑量組。 與模型組相比,*P＜0.05。圖6 GNP 對SAH 大鼠模型顳葉皮層神經(jīng)細胞凋亡的影響(n=6)Note. A, Sham+vehicle group. B, SAH+vehicle group. C, SAH+GNP low dose group. D, SAH+GNP high dose group. Compared with model group, *P＜0.05.Figure 6 Effects of GNP on TUNEL positive nerve cells in the temporal cortex of the SAH rat model

3 討論

在EBI 的一系列病理改變中,氧化應(yīng)激損傷是其中一個重要環(huán)節(jié)[3]。 在這一階段,高氧飽和度的動脈血進入蛛網(wǎng)膜下腔刺激腦組織并產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),造成一系列細胞內(nèi)容物的嚴重損傷。 除了造成出血部位鄰近腦組織損傷外,還可以引起遠隔部位微循環(huán)障礙[17],導致全腦細胞缺血缺氧及廣泛的神經(jīng)元去極化損害[18-19]。 該過程中,神經(jīng)細胞壞死及凋亡會造成血腦屏障的破壞并形成惡性循環(huán),最終導致不可逆的腦組織壞死[20-21]。 另一方面,在各種損傷因素的作用下,作為內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的核心調(diào)控樞紐,Nrf2通路會被激活并啟動下游基因轉(zhuǎn)錄,上調(diào)多種抗氧化酶的表達,通過負反饋以減輕氧化應(yīng)激導致的細胞損傷和凋亡[22]。

GNP 是近年被篩選鑒定出來的一種新的胰高血糖素樣肽- 1 受體(glucagon-like peptide 1 receptor, GLP-1R)激動劑,具有與GLP-1R 激動劑類似的神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護功能[7]。 并在抗氧化應(yīng)激、抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抗炎、修復受損的神經(jīng)細胞、促進神經(jīng)生長等多個方面表現(xiàn)出良好的療效[23]。其作用機制與Nrf2 通路的激活及下游抗氧化物質(zhì)的表達上調(diào)密切相關(guān)[9]。 在本研究中,給藥時間為造模后30 min 給藥,目的是研究GNP 對SH 的早期保護效果和機制。 在模型死亡率及神經(jīng)細胞凋亡情況方面,本研究證實了GNP 雖然不能減少蛛網(wǎng)膜下腔出血的吸收,但可有效減輕SAH 后EBI 情況。研究并通過檢測各組大鼠顳葉皮層組織中MDA 水平,Nrf2 及下游抗氧化酶HO-1、NQO-1、GST 的蛋白表達情況,進一步推測GNP 對SAH 后EBI 的神經(jīng)保護作用是通過Nrf2 通路來進行調(diào)節(jié)的。

MDA 是作為脂質(zhì)過氧化后的重要產(chǎn)物,可以反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,間接反映了細胞氧化損傷程度[24]。 本研究中,模型組大鼠顳葉皮層中MDA 含量明顯增加,符合SAH 后EBI 改變；但GNP干預后MDA 的含量均有所下降,且GNP 高劑量組下降更為明顯,提示GNP 能夠減輕SAH 造成的顳葉皮層的氧化損傷。

正常情況下,Nrf2 定位于細胞質(zhì)中,與胞質(zhì)結(jié)合蛋白(Keap1)相互結(jié)合；當機體處于各種應(yīng)激狀態(tài)時,Nrf2 與Keap1 解離,轉(zhuǎn)移到細胞核,與Maf 蛋白形成異二聚體；然后該異二聚體再與抗氧化應(yīng)答元件(ARE)結(jié)合,調(diào)控Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄活性,產(chǎn)生直接或間接抗氧化作用[5,25-26]。HO-1 是熱休克蛋白中的一種,在正常組織中呈低表達,但在氧化應(yīng)激狀態(tài)下會被大量誘導表達,以增加機體抗氧化能力[6]。 NQO1 是一種調(diào)節(jié)細胞內(nèi)物質(zhì)處于氧化還原狀態(tài)的黃素酶,以NAD(P)H 為受體,對各種代謝引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)均具有一定的保護作用[27]。 GST 屬于超級Ⅱ相解毒酶的基因家族,其催化谷胱甘肽(glutathione hormone,GSH)與底物之間的相互作用,清除有害化學物質(zhì)并進行解毒,在防治組織損傷方面作用顯著[28]。 本研究中,兩種劑量的GNP 雖然均不能減少蛛網(wǎng)膜下腔出血的吸收,但都可激活顳葉皮層神經(jīng)細胞的Nrf2 通路并明顯上調(diào)下游抗氧化酶HO-1、NQO-1、GST 的蛋白表達,最終減輕神經(jīng)細胞的凋亡,提示GNP 對SAH 后神經(jīng)細胞的保護作用與Nrf2 通路的激活存在密切關(guān)系。 低劑量的GNP 雖然能減輕細胞凋亡,但并不能減少SAH 對動物模型造成的死亡,僅高劑量治療能夠降低其死亡率百分比,提示GNP 對SAH的治療作用存在一定的劑量依賴效應(yīng)。

由于動物來源及條件限制,本研究未能擴展GNP 劑量及時間分層并在Nrf2 基因敲除動物模型中驗證GNP 對SAH 的神經(jīng)保護作用,存在一定的不足。 另外,本研究雖然觀察到GNP 高劑量組死亡率百分比有所下降,但并未能得出統(tǒng)計學差異,考慮與實驗納入樣本量不足所致。

綜上所述,本研究表明,GNP 50 mg/kg 及100 mg/kg 兩種治療劑量在大鼠SAH 造模后24 h 可抑制顳葉皮層的神經(jīng)細胞凋亡,該效應(yīng)存在一定的劑量依賴,高劑量治療并能進一步下降實驗動物死亡率,其作用機制可能與通過激活內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)Nrf2 通路,上調(diào)下游抗氧化酶發(fā)揮對神經(jīng)細胞的保護作用密切相關(guān)。