羅嘉慧盧秋翰李國(guó)萃張京京叢 喆魏 強(qiáng)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,新發(fā)再發(fā)傳染病動(dòng)物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

CD8+T 細(xì)胞在多種病毒感染性疾病的免疫控制中起著至關(guān)重要的作用,一般認(rèn)為對(duì)病毒復(fù)制有更好控制能力的患者擁有更強(qiáng)的特異性T 細(xì)胞應(yīng)答,其CD8+T 細(xì)胞也具有更高的細(xì)胞因子生產(chǎn)能力[1-4],但仍需要更多的相關(guān)研究來(lái)支持。 CD8+T細(xì)胞活性測(cè)定對(duì)細(xì)胞功能評(píng)定直接相關(guān)。 由于實(shí)驗(yàn)條件限定,通常情況下細(xì)胞及組織常冷凍(-80℃、液氮等)保存[5-6],凍存會(huì)對(duì)細(xì)胞的部分理化狀態(tài)造成影響[7],但在多大程度上影響細(xì)胞活性,缺乏實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 因此,通過(guò)實(shí)際樣本測(cè)定,了解凍存對(duì)其活性的影響,有重要的實(shí)際應(yīng)用意義,也為今后的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色實(shí)驗(yàn)提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

9 只SPF 級(jí)中國(guó)恒河猴,4 只雌性,5 只雄性,年齡為3～6 歲,體重約4 ～5 kg,均購(gòu)自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所[SCXK(京)2015-0011]。 實(shí)驗(yàn)前通過(guò)免疫熒光法篩查,排除猴皰疹病毒,猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒,猴免疫缺陷病毒及猴T 淋巴細(xì)胞性I 型病毒。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[SYXK(京)2017-0027],實(shí)驗(yàn)進(jìn)程遵循3R 原則。本實(shí)驗(yàn)使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物程序通過(guò)了中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)的批準(zhǔn)(XJ19006)。

1.2 主要試劑與儀器

Cell Stimulation Cocktail(500×)(Cat.00-4975)購(gòu)自eBioscience 公司；BD HorizonTMBV605 Mouse Anti-Human CD3(Cat. 562994)、BD PharmingenTMFITC Mouse Anti-Human CD8 (Cat. 557085)、 BD HorizonTMBV421 Mouse Anti-Human MIP-1β(Cat.562900)、BD HorizonTMPE-CF594 Mouse Anti-Human CD107a(Cat. 562628)、BD Cytofix/CytopermTMBD Cytofix/Cytoperm Plus Kit(with BD GolgiStop)(Cat.554715)購(gòu)自BD Pharmingen 公司；Brilliant Violet 421TManti-human IL-2 Antibody(Cat. 500328)、PE anti-human TNF-α Antibody(Cat. 502909)、Zombie NIRTMFixable Viability Kit(Cat.423106)、Brefeldin A(Cat. 420601)、 Brilliant Violet 510TManti-human IFN-γ Antibody(Cat. 502544)購(gòu)自BioLegend 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣本采集和外周血單個(gè)核細(xì)胞制備

使用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)采血管采集猴抗凝全血,使用Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單核淋巴細(xì)胞,一部分新鮮細(xì)胞直接用于檢測(cè)。 一部分使用加入了10% DMSO 的胎牛血清作為凍存液凍存于-80℃和液氮中。

1.3.2 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色

淋巴細(xì)胞懸液加入48 孔板中,每孔1 mL,設(shè)陽(yáng)性刺激組和陰性對(duì)照組。 陽(yáng)性刺激組加入1×陽(yáng)性刺激物,陰性對(duì)照組只加培養(yǎng)基。 1 h 后加入布雷菲德菌素A(Brefeldin A),GolgiStop 和CD107a 抗體,于37℃5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 h,收細(xì)胞進(jìn)行流式數(shù)據(jù)分析[8-12]。

收取細(xì)胞,使用細(xì)胞死活染料(Zombie NIRTMFixable Viability Kit)將細(xì)胞在室溫下染色20 min。然后洗滌細(xì)胞并在4℃下用表面染色混合物染色30min。 隨后將PBMC 洗滌2 次,然后用固定/透化溶液Fixation/Permeabilization solution 在4℃下固定并透化20 min。 隨后將細(xì)胞在用1 ∶10 稀釋的Perm/WashTMBuffer 中洗滌兩次。 然后在4℃下用胞內(nèi)染色混合物染色30 min。 洗滌后將細(xì)胞重懸于1%多聚甲醛中,并在4℃下在黑暗中儲(chǔ)存不超過(guò)24 h 直至分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)由BD ArialⅡ流式細(xì)胞儀收集,從每個(gè)樣品收集30000 個(gè)淋巴細(xì)胞。 采用FlowJo 10 對(duì)多色流式細(xì)胞儀上機(jī)結(jié)果進(jìn)行分析,使用Graphpad 8 軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析,不同組數(shù)據(jù)間進(jìn)行t檢驗(yàn)分析,以P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異界限。

2 結(jié)果

2.1 不同保存條件下細(xì)胞存活率

保存條件對(duì)細(xì)胞狀態(tài)影響較大。 新鮮分離的PBMC 中活細(xì)胞占(95.19±3.37)%,而經(jīng)液氮凍存1 周后,活細(xì)胞比例為(84.23±4.35)%,凍存1 年后,活細(xì)胞占(54.43±6.79)%,顯著低于經(jīng)液氮凍存1 周后的細(xì)胞(P＜0.0001)。 -80℃凍存1 周后活細(xì)胞比例為(75.46±4.50)%,凍存1 年后活細(xì)胞只占(40.63±5.26)%,顯著低于-80℃凍存1 周后的細(xì)胞(P＜0.0001)(圖1)。

2.2 陽(yáng)性刺激物刺激淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子流式結(jié)果

以CD8+T 淋巴細(xì)胞群做為目的細(xì)胞,以同型對(duì)照為基準(zhǔn)劃十字門。 使用PMA 和離子霉素Inomycin 做為陽(yáng)性刺激物刺激培養(yǎng)新鮮細(xì)胞6 h后,細(xì) 胞 高 表 達(dá)MIP-1β、 IL-2、 IFN-γ、 TNF-α 和CD107a。 見(jiàn)圖2。

注:與新鮮細(xì)胞比較,****P＜0.0001；與細(xì)胞液氮凍存一周比較,***P＜0.001,****P＜0.0001；與細(xì)胞-80℃凍存一周比較,***P＜0.001,****P＜0.0001；與細(xì)胞液氮凍存一年比較,***P＜0.001。圖1 不同保存條件下PBMC 的存活率Note. Comparing to fresh cells, ****P＜0.0001. Comparing to cell frozen for a week in liquid nitrogen, ***P＜0.001,****P＜0.0001. Comparing to cell frozen for a week in -80℃, ***P＜0.001,****P＜0.0001. Comparing to cell frozen for a year in liquid nitrogen, ***P＜0.001.Figure 1 Survival rate of PBMC under different storage conditions

圖2 流式分析CD8+ T 淋巴細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)情況Figure 2 Flow cytometric analysis of intracellular cytokine expression in CD8+ T lymphocytes

2.3 不同保存條件下胞內(nèi)細(xì)胞因子及細(xì)胞脫粒標(biāo)志物表達(dá)結(jié)果

PMA 和離子霉素Inomycin 做為陽(yáng)性刺激物培養(yǎng)PBMC 6 h 后,不同保存條件下胞內(nèi)細(xì)胞因子及細(xì)胞脫粒標(biāo)志物表達(dá)量如表1 所示,在MIP-1β 的表達(dá)中,新鮮細(xì)胞與凍存一周的細(xì)胞沒(méi)有顯著差異,但液氮凍存超過(guò)一年的細(xì)胞的表達(dá)量顯著高于新鮮細(xì)胞(P＜0.001),液氮凍存一周的細(xì)胞與80℃凍存一周的細(xì)胞沒(méi)有顯著差異,液氮凍存超過(guò)一年的細(xì)胞與80℃凍存超過(guò)一年的細(xì)胞沒(méi)有顯著差異。在IL-2 的表達(dá)中,各組別均無(wú)顯著差異。 在IFN-γ的表達(dá)中,新鮮細(xì)胞的表達(dá)量顯著高于液氮凍存一周的細(xì)胞(P＜0.0001),新鮮細(xì)胞與液氮凍存超過(guò)一年的細(xì)胞沒(méi)有顯著差異,液氮凍存一周的細(xì)胞與80℃凍存一周的細(xì)胞沒(méi)有顯著差異,液氮凍存超過(guò)一年的細(xì)胞與80℃凍存超過(guò)一年的細(xì)胞沒(méi)有顯著差異。 在TNF-α 的表達(dá)中,新鮮細(xì)胞與凍存一周的細(xì)胞沒(méi)有顯著差異,但液氮凍存超過(guò)一年的細(xì)胞的表達(dá)量顯著高于新鮮細(xì)胞(P＜0.0001),液氮凍存一周的細(xì)胞與80℃凍存一周的細(xì)胞沒(méi)有顯著差異,液氮凍存超過(guò)一年的細(xì)胞與80℃凍存超過(guò)一年的細(xì)胞沒(méi)有顯著差異。 在CD107a 的表達(dá)中,各組別均無(wú)顯著差異。 (圖3)

表1 不同保存條件下胞內(nèi)細(xì)胞因子及細(xì)胞脫粒標(biāo)志物表達(dá)量Table 1 Expression of intracellular cytokines and cell degranulation markers under different storage conditions

圖3 不同保存條件下胞內(nèi)細(xì)胞因子及細(xì)胞脫粒標(biāo)志物表達(dá)情況分析Figure 3 Analysis of the expression of intracellular cytokines and cell degranulation markers under different storage conditions

3 討論

近年來(lái),越來(lái)越多的研究支持血液CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)與多種病毒感染性疾病控制有著密切的關(guān)系,CD8+T 細(xì)胞主要通過(guò)分泌細(xì)胞毒性顆粒和細(xì)胞因子來(lái)發(fā)揮其效應(yīng)功能,因此同時(shí)選取CD8+T 細(xì)胞的細(xì)胞脫粒標(biāo)志物及4 種細(xì)胞因子(CD107a,IFN-γ,MIP-1β,TNF-α 和IL-2)的分泌量來(lái)評(píng)估CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)的水平,是現(xiàn)在較多采用的一種方法[2-13]?，F(xiàn)今部分測(cè)量CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)水平的實(shí)驗(yàn)使用新鮮的細(xì)胞[14-15],但是由于實(shí)驗(yàn)安排的不同,大部分測(cè)量CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)水平的實(shí)驗(yàn)都需要用到凍存細(xì)胞[11],但是,在不同條件下,凍存會(huì)多大程度上影響細(xì)胞活性,缺乏確切的實(shí)驗(yàn)依據(jù),實(shí)驗(yàn)樣本的凍存條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響尚未得到評(píng)估。

本實(shí)驗(yàn)在保證凍存液的成分,血細(xì)胞的分離條件、細(xì)胞復(fù)蘇的過(guò)程等變量條件一致的情況下,探究?jī)龃鏃l件對(duì)恒河猴CD8+T 細(xì)胞活性的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同凍存條件對(duì)細(xì)胞存活率影響較大,細(xì)胞存活率因凍存而衰減,凍存時(shí)間越長(zhǎng),凍存溫度越高,細(xì)胞死亡率越高。 不同凍存條件的細(xì)胞因子及細(xì)胞脫粒標(biāo)志物的表達(dá)量也不同,總體來(lái)說(shuō),短時(shí)間凍存的細(xì)胞反應(yīng)水平與新鮮細(xì)胞最為接近,而長(zhǎng)時(shí)間凍存的細(xì)胞,在MIP-1β 和TNF-α 的表達(dá)量上與新鮮細(xì)胞有顯著的差異。 由于本實(shí)驗(yàn)采集自恒河猴實(shí)驗(yàn)樣本,數(shù)量受限,未做樣本差異分析,條件充許時(shí),盡量采集足量樣本,并排除因樣本差異造成可能的影響。 因此為了保持正常的CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)和高的細(xì)胞存活率,應(yīng)使用新鮮細(xì)胞或短期凍存的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)水平的實(shí)驗(yàn),而在測(cè)定長(zhǎng)期保存標(biāo)本中,也應(yīng)充分了解活性因凍存而有所變化。