王珍，賀磊，肖英平，盧先東，劉艷紅，陸雯，王首鋒

（1.綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司，杭州310052；2.寧波愛基因科技有限公司，浙江 寧波315000；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，杭州310021；4.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，杭州310058）

據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）統(tǒng)計(jì)，全球每年有近15 億人感染食源性疾病，其中70%是由食品中的致病微生物污染引起的[1]，而由產(chǎn)毒蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）引起的食物中毒事件占總的細(xì)菌性食物中毒事件的11.4%[2]。蠟樣芽孢桿菌是革蘭陽(yáng)性兼性厭氧產(chǎn)芽孢菌，通過(guò)產(chǎn)生腹瀉毒素和嘔吐毒素導(dǎo)致人體食物中毒，可引起惡心、嘔吐、腹脹、腹痛及腹瀉等不適癥狀。陸湘華等[3]的研究結(jié)果顯示，多種食品如蒸煮的米飯和炒飯、調(diào)料、干制品（面粉、奶粉等）、豆類食品、肉制品等引起的食物中毒，都與蠟樣芽孢桿菌有關(guān)。

傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要是采取選擇性培養(yǎng)基對(duì)蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，再用生化反應(yīng)鑒定，不僅耗時(shí)長(zhǎng)而且操作繁雜，特別是在蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)中，為了得到豐富的游離芽孢，培養(yǎng)時(shí)間甚至需要5～7 d[4]。近年來(lái)，蠟樣芽孢桿菌快速檢測(cè)方法發(fā)展迅速，主要包括傳統(tǒng)檢測(cè)方法和多種核酸擴(kuò)增技術(shù)（nucleic acid amplification technique,NAAT）。目前報(bào)道的有普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）、多重PCR（multiplex PCR, mPCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）、疊氮溴化丙錠-定量PCR（propidium monoazide-quantitative PCR,PMA-qPCR）、微 滴 數(shù) 字PCR（microdrop digital PCR,ddPCR）、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增PCR（loop-mediated isothermal amplification-PCR, LAMP-PCR）及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）等[5-9]。賈雅菁等[10]使用實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（real-time loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP）技術(shù)，在等溫（60～65 ℃）條件下，于短時(shí)間（80 min）內(nèi)對(duì)牛乳中的蠟樣芽孢桿菌實(shí)現(xiàn)了快速檢測(cè)。與普通PCR、熒光定量PCR 技術(shù)相比，LAMP的突出優(yōu)點(diǎn)是擴(kuò)增效率高且不需要昂貴的精密儀器等，但不足之處是在結(jié)果判讀時(shí)，通過(guò)肉眼觀察濁度或電泳后梯形條帶，存在主觀性強(qiáng)、易造成污染的情況[11]。

近年來(lái)，核酸檢測(cè)方法在微流控裝置中的集成，為臨床、食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)應(yīng)用開發(fā)方便、廉價(jià)和高效的診斷工具提供了一種極有前途的方法[12-14]。微流控技術(shù)不斷與核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)設(shè)計(jì)芯片結(jié)構(gòu)、改進(jìn)加樣模式與檢測(cè)方式，實(shí)現(xiàn)了微生物的核酸提取、擴(kuò)增、檢測(cè)一體化，并具有多靶點(diǎn)聯(lián)檢等傳統(tǒng)核酸檢測(cè)方法所不具備的優(yōu)勢(shì)，即對(duì)儀器依賴程度小、對(duì)人員操作要求低、對(duì)樣品需求量小、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，適合在各種環(huán)境中對(duì)食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)[15-17]。離心式微流控芯片即時(shí)檢驗(yàn)（point-of-care testing, POCT）在動(dòng)物源性成分快速鑒定中已有應(yīng)用[18]，而本研究嘗試用離心盤式微流控芯片，利用離心力驅(qū)動(dòng)，通過(guò)物理反應(yīng)區(qū)域的合理分配，以蠟樣芽孢桿菌hblA基因序列為目的條帶設(shè)計(jì)2對(duì)引物；利用LAMP技術(shù)，在反應(yīng)體系中加入熒光染料SYTO-9，在恒溫?cái)U(kuò)增過(guò)程中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)，建立蠟樣芽孢桿菌的微流控芯片恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性質(zhì)粒與菌株

實(shí)驗(yàn)所用陽(yáng)性質(zhì)粒參考蠟樣芽孢桿菌溶血素hblA基因序列（GenBank登錄號(hào)：CP040340.1）片段，委托上海百力格生物科技有限公司合成并連接到載體pUC57上，將構(gòu)建成功的蠟樣芽孢桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pUC57-hblA。

實(shí)驗(yàn)所用的24 個(gè)菌株中，除了蠟樣芽孢桿菌（編號(hào)：LCLY001）為實(shí)驗(yàn)室所分離，其余菌株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心（Center for Medical Culture Collection,CMCC），網(wǎng)址為http://www.cmccb.org.cn/cmccbnew/Germ/Germ_sel.php；北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司[美國(guó)典型菌種保藏中心（American Type Culture Collection,ATCC）代理商]，網(wǎng)址為http://www.bzwzw.com/index.php/List/index/id/72.html；中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection,CICC），網(wǎng)址為http://www.china-cicc.org/order.html。菌株信息詳見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株Table 1 Strains for experiment

1.1.2 試劑

胰酪胨大豆肉湯（tryptic soy booth, TSB）培養(yǎng)基、甘露醇卵黃多黏菌素（mannitol egg yolk polymyxin,MYP）、瓊脂（山東省青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司）；熒光預(yù)混液（主要成分為Bst聚合酶、dNTP、SYTO-9等）、核酸提取液[主要成分為Tris-HCl、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）]、聚丙烯酰胺、鹽酸胍等（浙江省寧波愛基因科技有限公司）。實(shí)驗(yàn)中所用其他試劑均為分析純，由廣東光華科技股份有限公司提供；所用水均為超純水。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Lab dancer S25 漩渦振蕩儀（德國(guó)IKA 公司）；TG16KR 高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；HFSafe-1500Lc 生物安全柜（上海力康公司）；LRH-250F 型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；GI80TW 型高壓滅菌器[致微（廈門）儀器有限公司]；MA2000 微流控芯片檢測(cè)儀（浙江省寧波愛基因科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

恒溫?cái)U(kuò)增的特異性取決于引物設(shè)計(jì)[19-21]?；谙灅友挎邨U菌溶血素hblA基因序列，在線（http://primerexplorer.jp/e/index.html）設(shè)計(jì)2 對(duì)引物，其中上游引物F3/FIP和下游引物B3/BIP序列見表2。

1.2.2 模板DNA 的制備

取1 mL 含有實(shí)驗(yàn)菌株的培養(yǎng)液加入到1.5 mL無(wú)菌離心管中，以8 000 r/min 離心5 min，盡量吸棄上清液；加入200 μL 核酸提取液和0.2 g 玻璃珠（直徑500～600 μm），劇烈振蕩混勻5～10 min，100 ℃恒溫加熱5 min；以1.2×104r/min離心2 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中。

1.2.3 微流控芯片恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件

恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系為5 μL，其中包括微流控芯片的固定體系1.5 μL。用1.2.1節(jié)的引物混合工作液固定到微流控芯片后，于65 ℃條件下干燥10 min。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)，先將1.2.2 節(jié)中制備的核酸提取物15 μL與熒光預(yù)混液10 μL進(jìn)行混合，再加入到預(yù)先固定有引物的微流控芯片的點(diǎn)樣孔中，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增。以1.0×104μL－1的蠟樣芽孢桿菌基因組DNA為檢測(cè)靶標(biāo)，設(shè)置恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)溫度分別為59、61、63.5和65 ℃，其他實(shí)驗(yàn)條件相同，反應(yīng)時(shí)間30 min，每30 s 采集一次熒光信號(hào)，根據(jù)出現(xiàn)的擴(kuò)增曲線進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.2.4 微流控芯片恒溫?cái)U(kuò)增特異性實(shí)驗(yàn)

用1.2.2 節(jié)中的方法提取實(shí)驗(yàn)菌株的DNA，實(shí)驗(yàn)共分成4組，每組8個(gè)樣品，分別包含蠟樣芽孢桿菌、陰性對(duì)照和其他6株實(shí)驗(yàn)菌株。用1.2.3節(jié)中的反應(yīng)體系和擴(kuò)增方法對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)菌株和實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，以此來(lái)驗(yàn)證各個(gè)檢測(cè)引物的特異性是否滿足檢測(cè)要求。

1.2.5 微流控芯片恒溫?cái)U(kuò)增靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

分別通過(guò)蠟樣芽孢桿菌菌液樣品與陽(yáng)性質(zhì)粒pUC57-hblA樣品對(duì)微流控芯片恒溫?cái)U(kuò)增靈敏度進(jìn)行檢測(cè)。

接種蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株于新鮮的無(wú)菌胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基上，在36 ℃條件下培養(yǎng)18 h，隨后用無(wú)菌生理鹽水將菌液稀釋至1.7×105、1.7×104、1.7×103、1.7×102、1.7×101CFU/mL 系列濃度，并進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。分別對(duì)每個(gè)梯度進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌模板DNA的制備，用微流控芯片恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系和擴(kuò)增方法對(duì)蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

將蠟樣芽孢桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒pUC57-hblA配置成1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100μL－1的溶液并設(shè)置陰性對(duì)照，用微流控芯片恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系和擴(kuò)增方法對(duì)蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 微流控芯片恒溫?cái)U(kuò)增重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

將含有蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)靶點(diǎn)基因的陽(yáng)性質(zhì)粒作為實(shí)驗(yàn)材料，其濃度為1×104μL－1，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并且計(jì)算其變異系數(shù)（coefficient of variation,CV），以此來(lái)驗(yàn)證檢測(cè)引物的重復(fù)性。

1.2.7 人工污染米飯

選擇不含蠟樣芽孢桿菌的米飯作為實(shí)驗(yàn)樣品。取25 g 樣品加入到225 mL 無(wú)菌生理鹽水中混合均勻，再加入1 mL 新鮮的蠟樣芽孢桿菌菌液，混合均勻后稀釋至5.7×106、5.7×105、5.7×104、5.7×103、5.7×102、5.7×101、5.7×100CFU/mL 系列濃度，并同步計(jì)數(shù)，分別利用蠟樣芽孢桿菌模板制備中的方法提取DNA，用微流控芯片恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系和擴(kuò)增方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增溫度優(yōu)化

采用微流控芯片聯(lián)合恒溫進(jìn)行擴(kuò)增，不需要經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增的變性、退火和延伸等變溫過(guò)程，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程在恒溫條件下完成。引物等已經(jīng)預(yù)先固定到微流控芯片上，最終微流控芯片反應(yīng)體系中已包含反應(yīng)所需的引物。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，在微流控芯片檢測(cè)儀上進(jìn)行微流控芯片的恒溫?cái)U(kuò)增，儀器會(huì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，根據(jù)熒光檢測(cè)的有效擴(kuò)增曲線進(jìn)行判讀，任意一孔或者多孔中有標(biāo)準(zhǔn)的S 型擴(kuò)增曲線，則該孔被判斷為陽(yáng)性，即該樣本中含有對(duì)應(yīng)檢測(cè)孔的核酸；沒有擴(kuò)增曲線的孔被判斷為陰性，即該樣本不含有對(duì)應(yīng)檢測(cè)孔的核酸。由于在不同溫度條件下，引物自身成環(huán)的效率不同，因此，為了提高反應(yīng)效率，需要對(duì)LAMP 引物進(jìn)行溫度優(yōu)化，以選取最佳的反應(yīng)條件，結(jié)果如圖1所示，出現(xiàn)典型曲線的時(shí)間僅需15 min。

從中可知：在該引物條件下，LAMP 反應(yīng)在63.5 ℃有最佳反應(yīng)效率，且其閾值（CT）最小，熒光值最大。這表明在63.5 ℃條件下，設(shè)計(jì)的引物自身成環(huán)效率更高，反應(yīng)速率更快。在相同的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，LAMP反應(yīng)在該溫度條件下有著更多的產(chǎn)物，更有利于檢測(cè)。

圖1 LAMP反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Temperature optimization results of LAMP reaction

2.2 檢測(cè)方法的特異性

用微流控芯片恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系和擴(kuò)增方法，在蠟樣芽孢桿菌的微流控檢測(cè)芯片1～8 號(hào)加樣孔中，分別加入細(xì)菌核酸與熒光預(yù)混液的混合物，結(jié)果如圖2所示。

從中可以看出，在這4組實(shí)驗(yàn)中，每組的蠟樣芽孢桿菌均為陽(yáng)性，其他非蠟樣芽孢桿菌如鼠傷寒沙門菌、福氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌等23 種細(xì)菌均為陰性。說(shuō)明所選的蠟樣芽孢桿菌引物未與其他細(xì)菌出現(xiàn)交叉核酸擴(kuò)增反應(yīng)，特異性好。

圖2 蠟樣芽孢桿菌微流控芯片LAMP特異性測(cè)試結(jié)果Fig.2 Specific testing results of LAMP with microfluidic chip for B.cereus

2.3 檢測(cè)方法的靈敏度

對(duì)蠟樣芽孢桿菌菌液樣品梯度稀釋檢測(cè)結(jié)果如圖3 所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在170 CFU/mL 濃度以上均能檢測(cè)出蠟樣芽孢桿菌陽(yáng)性，即靈敏度達(dá)170 CFU/mL，等同于熒光定量PCR 產(chǎn)品的檢測(cè)靈敏度[22-23]。利用微流控體系對(duì)蠟樣芽孢桿菌菌液進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，最快可在16 min 內(nèi)獲得陽(yáng)性判定結(jié)果；而對(duì)于最低檢出限濃度的樣品，在35 min內(nèi)可完成反應(yīng)和結(jié)果判定。

對(duì)蠟樣芽孢桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒pUC57-hblA進(jìn)行梯度稀釋后的檢測(cè)結(jié)果如圖4 所示。結(jié)果顯示：1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100μL－1蠟樣芽孢桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒pUC57-hblA的最快出峰時(shí)間為5 min，最慢為15 min 左右，經(jīng)過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)20 次，得出最低檢出限為10 μL－1。

2.4 檢測(cè)方法的重復(fù)性

對(duì)同一濃度（1×104μL－1）的蠟樣芽孢桿菌質(zhì)粒進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)和驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示。結(jié)果顯示，對(duì)固定有蠟樣芽孢桿菌引物的微流控芯片進(jìn)行8 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，8 次均出現(xiàn)典型的陽(yáng)性曲線，且閾值（CT）接近。

從MA2000 微流控芯片檢測(cè)儀（浙江省寧波愛基因科技有限公司）上分別讀取閾值（CT），并根據(jù)CT計(jì)算變異系數(shù)（CV）值，結(jié)果如表3所示。從中可知，檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)的CV＜5%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

圖4 陽(yáng)性質(zhì)粒pUC57-hblA 微流控芯片LAMP 反應(yīng)靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Sensitivity testing results of LAMP with microfluidic chip for pUC57-hblA

圖5 陽(yáng)性質(zhì)粒pUC57-hblA微流控芯片LAMP的重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Repeatability testing results of LAMP with microfluidic chip for pUC57-hblA

表3 微流控芯片LAMP檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的變異系數(shù)分析Table 3 Analysis of the coefficient of variation on the detection of B. cereus by LAMP with microfluidic chip

2.5 人工污染米飯蠟樣芽孢桿菌最低檢出限

人工污染米飯中的蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)后終濃度為5.7×106CFU/mL，梯度稀釋后用核酸提取液提取DNA，用微流控芯片恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系和擴(kuò)增方法進(jìn)行微流控芯片恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。其中，1～6 號(hào)樣本檢測(cè)孔出現(xiàn)擴(kuò)增峰，儀器判定為陽(yáng)性，即本實(shí)驗(yàn)建立的微流控芯片結(jié)合LAMP的檢測(cè)方法對(duì)人工污染米飯中蠟樣芽孢桿菌的最低檢出限為57 CFU/mL（菌液濃度以稀釋10 倍換算，米飯樣品中蠟樣芽孢桿菌的最低檢出限為570 CFU/g），比170 CFU/mL的靈敏度提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微流控體系對(duì)蠟樣芽孢桿菌米飯樣品梯度檢測(cè)，最快可在10 min 內(nèi)獲得陽(yáng)性判定結(jié)果，而對(duì)于最低檢出限濃度的米飯樣品，在45 min出現(xiàn)特征曲線時(shí)可判定結(jié)果，整個(gè)過(guò)程不超過(guò)1 h。

2.6 微流控芯片

在微流控芯片的制作時(shí)，采用微量點(diǎn)樣儀將各個(gè)核酸引物均勻地點(diǎn)布在微流控芯片上的特定位置區(qū)域，芯片反應(yīng)孔的布局可以設(shè)計(jì)成多種形狀。

如圖7所示，每個(gè)芯片有8個(gè)加樣孔，每個(gè)加樣孔對(duì)應(yīng)編號(hào)1、2、3、4 的反應(yīng)孔，可以實(shí)現(xiàn)一個(gè)樣品的多靶點(diǎn)檢測(cè)，并設(shè)置空白對(duì)照與內(nèi)參對(duì)照（即人工合成的靶基因片段）進(jìn)行環(huán)境監(jiān)控與質(zhì)量控制，可以有效防止出現(xiàn)假陽(yáng)性與假陰性的情況，并能減小反應(yīng)體積，有效降低反應(yīng)成本。

3 討論

圖6 微流控芯片LAMP檢測(cè)人工污染米飯中蠟樣芽孢桿菌的檢出限Fig.6 Limit of detection of B.cereus in artificially polluted rice by LAMP with microfluidic chip

圖7 微流控芯片F(xiàn)ig.7 Microfluidic chip

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微流控芯片技術(shù)與恒溫核酸擴(kuò)增的結(jié)合，充分發(fā)揮了兩者的優(yōu)點(diǎn)，不僅分析速度快，而且由于不用配制引物部分的反應(yīng)體系，比傳統(tǒng)LAMP 方法更方便；且微流控芯片體積小，消耗的試劑少（微流控芯片法通常為微納升水平），成本降低。同時(shí)，微流控芯片與恒溫核酸擴(kuò)增結(jié)合技術(shù)的檢測(cè)靈敏度較高，蠟樣芽孢桿菌微流控芯片恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)靈敏度為170 CFU/mL，比傳統(tǒng)LAMP 方法靈敏度[20]高出10 倍。通過(guò)人工污染米飯中的蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，微流控芯片恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的最低檢出限實(shí)際能達(dá)到57 CFU/mL（570 CFU/g），甚至更低，優(yōu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中推薦的方法（檢出限為1.04×102CFU/mL）[22]。核酸提取效率因不同的商業(yè)病原菌DNA 提取試劑盒（過(guò)濾法和磁珠法）而不同[24]，但對(duì)質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)研究表明，微流控芯片恒溫?cái)U(kuò)增方法的靈敏度能達(dá)到10 μL－1，并且陽(yáng)性檢出時(shí)間在10 min 之內(nèi)，優(yōu)于大部分同等靈敏度水平的分子生物學(xué)快速檢測(cè)方法（反應(yīng)時(shí)間一般在30 min至8 h內(nèi)）[25]。

有研究表明，相較于最常用的熒光染料SYBR GreenⅠ[10,26]，本研究選擇的熒光染料核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線重復(fù)性更好，并且對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的抑制更小[27-28]。hblA基因是一個(gè)與腹瀉毒素相關(guān)的溶血素BL基因（包括hblA、hblB、hblC和hblD）[29]。王振國(guó)等[12]、ZHANG 等[30]分別通過(guò)擴(kuò)增hblA、cytK、nheA和hblD基因來(lái)對(duì)蠟樣芽孢桿菌實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)；M?NTYNEN等[16]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)PCR篩選HblA基因以檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的方法比反向被動(dòng)膠乳凝集法（reversed passive latex agglutination assay,RPLA）更快，因此，hblA基因是一個(gè)用于篩選致病性蠟樣芽孢桿菌的常用基因。

傳統(tǒng)LAMP 方法最突出的問題是易造成假陽(yáng)性，而離心光盤式微流控POCT 核酸檢測(cè)芯片法實(shí)現(xiàn)了全封閉操作，可以避免氣溶膠的污染，正好彌補(bǔ)了這個(gè)缺陷。微流控POCT核酸檢測(cè)芯片法利用離心力進(jìn)行驅(qū)動(dòng)，具有主動(dòng)、可控、可調(diào)的優(yōu)點(diǎn)，很好地將LAMP技術(shù)整合于微流控芯片系統(tǒng)。同時(shí)，在微流控芯片上設(shè)置內(nèi)參對(duì)照，可以監(jiān)控實(shí)驗(yàn)過(guò)程是否正常實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)體系的全封閉化和微量化的功能，從而避免了人員操作造成的人為實(shí)驗(yàn)污染。

4 結(jié)論

利用蠟樣芽孢桿菌公開的hblA基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，上游引物為F3/FIP，下游引物為B3/BIP，加入熒光染料SYTO-9，應(yīng)用微流控芯片通過(guò)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光讀數(shù)來(lái)快速檢測(cè)米飯類食品中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特異性強(qiáng)、靈敏度高，米飯樣品中蠟樣芽孢桿菌的檢出限為570 CFU/g，菌液中蠟樣芽孢桿菌的檢出限為170 CFU/mL；質(zhì)粒檢出限低至10 μL－1，變異系數(shù)CV為2.02%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，可在10～45 min 內(nèi)出結(jié)果，檢測(cè)速度快，可用于米飯類食品中蠟樣芽孢桿菌的快速檢測(cè)。在多種核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAAT）中，LAMP 與微流控芯片結(jié)合的核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)，具備平行檢測(cè)和多重檢測(cè)的應(yīng)用潛力，可為多種致病菌防控的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢驗(yàn)（POCT）提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景廣闊。