余軍軍，梁立杰，藍(lán)棋浩，陳秋月，章 敏，寧 軍，韋 田通信作者

(1.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東 新興 527400；2.廣東省畜禽健康養(yǎng)殖與環(huán)境控制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 新興 527400；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

0 引言

替米考星(Tilmicosin，TILM)是由泰樂(lè)菌素的一種水解產(chǎn)物半合成的畜禽專用抗生素，該藥首先由英國(guó)ELanco動(dòng)物保健品公司在20世紀(jì)80年代開(kāi)發(fā)成功，目前在多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)用于畜禽生產(chǎn)中疾病的預(yù)防和治療[1]。替米考星為廣譜抗菌藥，因其體內(nèi)分布廣、半衰期長(zhǎng)、肺部高蓄積等特點(diǎn)，臨床主要用于治療牛、山羊、豬、雞等動(dòng)物呼吸系統(tǒng)疾病，特別用于治療和控制由雞毒支原體、豬胸膜肺炎放線桿菌和多殺性巴氏桿菌引起的雞豬呼吸道疾病[2]。替米考星具有肝、腎毒性，并可損害人體前庭和耳蝸神經(jīng)，長(zhǎng)期使用可引起過(guò)敏反應(yīng)和導(dǎo)致攜帶耐藥因子的菌株擴(kuò)散。因此，中國(guó)對(duì)動(dòng)物源食品中替米考星的最大允許殘留限量(MRL)做了嚴(yán)格規(guī)定[3]。目前，監(jiān)控替米考星殘留主要用動(dòng)物的可食用組織[4]，尿液中替米考星殘留的消除未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)旨在研究豬組織和尿液中替米考星殘留分布規(guī)律，探討替米考星殘留量在尿液與體內(nèi)組織間的相關(guān)性，預(yù)測(cè)體內(nèi)替米考星消除安全時(shí)尿液中替米考星殘留量，為活體快速檢測(cè)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器設(shè)備與試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(QQQ6410B)，美國(guó)Agilent科技有限公司；組織勻漿機(jī)(HM6300)，北京Lab Precition科技有限公司；氮吹儀(MV5)，北京萊伯泰科儀器有限公司；電子分析天平(BT125D)，德國(guó)Sartorius集團(tuán)；冷凍高速離心機(jī)(5804R)，德國(guó)Eppendorf公司；HLB固相萃取小柱(500 mg/6 CC)，美國(guó)Waters公司。

替米考星對(duì)照品(純度98.0%，德國(guó)Dr.公司)；甲醇、乙腈和甲酸(色譜純，德國(guó)默克公司)；正己烷、碳酸鈉、甲酸、甲基叔丁基醚、乙酸銨和甲酸銨(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；替米考星預(yù)混劑(含量20%，廣東溫氏大華農(nóng)科技有限公司)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)與管理

選擇健康、體重相近的三元雜商品豬21頭(40.0±1.5 kg)，隨機(jī)分成2組，分別為對(duì)照組1頭、實(shí)驗(yàn)組20頭。實(shí)驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼料基礎(chǔ)上添加2 g/kg的替米考星預(yù)混劑，連續(xù)飼喂15 d。實(shí)驗(yàn)組自停藥后第5、8、12、15天隨機(jī)選擇5頭豬，采集肌肉、肝臟、腎臟、肺臟、皮脂和尿液作為檢測(cè)樣品。

1.2 分析方法

1.2.1 溶液配制

替米考星儲(chǔ)備液(1 mg/mL):稱量50 mg替米考星對(duì)照品，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，置4℃冰箱中保存。使用時(shí)配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

4%磷酸二氫鈉溶液:準(zhǔn)確稱取二水合磷酸二氫鈉4 g置于100 mL容量瓶中，用純水溶解定容至刻度，搖勻，即得。

5%甲醇水溶液:移取50 mL甲醇置1 000 mL容量瓶中，用純水稀釋定容至刻度，搖勻，即得。

20%乙腈水:移取20 mL乙腈置100 mL容量瓶中，用純水稀釋定容至刻度，搖勻，即得。

1.2.2 樣品處理

尿液樣品:取1 mL尿液樣品，加入1 mL 4%磷酸二氫鈉溶液，渦旋混勻30 s，8 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)經(jīng)甲醇、水活化的HLB萃取小柱，用6 mL 5%甲醇水溶液淋洗，6 mL甲醇洗脫。洗脫液50℃水浴中氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)? mL 20%乙腈水溶液復(fù)溶，過(guò)膜，待測(cè)。

組織樣品:準(zhǔn)確稱取4.0 g試樣置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋30 s，超聲提取20 min，4 500 r/min離心10 min，上清液移入50 mL離心管中。用10 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并上清液，混勻。取5 mL提取液，50℃下氮?dú)獯抵两?，殘?jiān)尤? mL 20%乙腈水溶液，5 mL正己烷渦旋混勻后4 000 r/min離心10 min，移除正己烷層，下層液體按尿液樣品項(xiàng)下凈化。

1.2.3 儀器條件

色譜條件:色譜柱Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相0.2%甲酸水溶液:0.2%甲酸乙腈溶液(v:v，30:70)；流速為0.25 mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣體積為5 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓4.0 kV，霧化氣壓力55 psi；脫溶劑氣流速10 L/min；脫溶劑溫度350℃；替米考星的質(zhì)譜信息，如表1所示。

表1 替米考星的質(zhì)譜信息

2 結(jié)果與分析

2.1 組織中替米考星殘留及消除規(guī)律

不同時(shí)間點(diǎn)各組織中替米考星殘留量如表2所示。結(jié)果顯示，20%替米考星預(yù)混劑按推薦劑量連續(xù)用藥15 d后，替米考星在肝臟、腎臟和肺臟中的殘留量較高，在肌肉、皮脂中的殘留量低，停藥8 d后，替米考星在各組織中殘留量低于MRL。豬只停藥后替米考星在各組織中殘留消除速度不同，其中肺臟、肝臟和腎臟中的下降速度快，而肌肉、皮脂中的下降趨勢(shì)相對(duì)平緩，但也都呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)。

表2 豬停藥后不同時(shí)間點(diǎn)體內(nèi)各組織和尿液中替米考星的殘留濃度量(n=5)

2.2 休藥期計(jì)算

按照農(nóng)業(yè)部關(guān)于替米考星最大殘留限量[3]和歐盟對(duì)休藥期計(jì)算的有關(guān)規(guī)定[5]，利用WT1.4軟件按雙單側(cè)95%置信區(qū)間計(jì)算替米考星在豬組織中休藥期。恩諾沙星在各組織中的休藥期如表3所示。結(jié)果顯示，替米考星在豬肺臟中消除最慢，休藥期為16.71 d；肌肉中替米考星消除最快，休藥期為7.25 d。

表3 替米考星在各組織中休藥期

2.3 尿液、組織中替米考星殘留量相關(guān)性研究

以停藥后尿液中替米考星含量為橫坐標(biāo)，各組織中替米考星的含量為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，停藥后尿液中替米考星殘留量與豬體內(nèi)各組織中替米考星殘留量相關(guān)系數(shù)r>0.96，且p<0.05，表明尿液中與各組織中替米考星殘留具有高度的相關(guān)性。

2.4 尿液中替米考星殘留量區(qū)間預(yù)測(cè)

根據(jù)相關(guān)性分析得到的回歸方程，利用R軟件中的predict()函數(shù)計(jì)算組織中替米考星殘留量為MRL時(shí)相對(duì)應(yīng)尿液中替米考星殘留量值的平均值與其置信區(qū)間為0.99的預(yù)測(cè)區(qū)間[6]，計(jì)算結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示，當(dāng)體內(nèi)組織中替米考星殘留量為MRL時(shí)，尿液中替米考星殘留量預(yù)測(cè)范圍8.71～398.11 μg·L-1。

表4 尿液中替米考星殘留量預(yù)測(cè)范圍

A—肺臟；B—腎臟；C—肝臟；D—肌肉；E—皮脂

3 討論

由于在《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中沒(méi)有對(duì)肺臟中替米考星的最高殘留限量進(jìn)行要求[3]，考慮到食品安全風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)參考肉中替米考星MRL暫定豬肺臟中MRL為100 μg·kg-1，最后計(jì)算得休藥期為17 d，與《獸藥典》規(guī)定14 d差異不大[7]。

在實(shí)際生產(chǎn)中，通過(guò)對(duì)豬活體尿液樣品的檢測(cè)，根據(jù)建立的回歸方程，可以間接判斷豬體內(nèi)替米考星殘留量是否低于最大殘留限量。20世紀(jì)末開(kāi)始已有不少學(xué)者采用這種經(jīng)典回歸法來(lái)預(yù)測(cè)組織中藥物的殘留濃度，研究對(duì)象除動(dòng)物尿液[8]、血液[9]外，已擴(kuò)展到動(dòng)物毛發(fā)、視網(wǎng)膜以及趾甲等[10]，但在研究時(shí)均沒(méi)有考慮個(gè)體間和個(gè)體內(nèi)的差異，試驗(yàn)的重復(fù)性較差。作者在經(jīng)典回歸法的基礎(chǔ)上引入置信區(qū)間預(yù)測(cè)，考慮了個(gè)體間差異，通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)當(dāng)組織中替米考星濃度降至MRL時(shí)，尿液中替米考星殘留量區(qū)間下限為8.71 μg·L-1，較經(jīng)典回歸法計(jì)算的最低濃度11.75 μg·L-1更安全，更符合動(dòng)物可食組織中殘留研究。