李友英，藍 嵐，潘 瑤，楊丹嬌，吳建平，張康林，湯 承

(1.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095；2.甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學研究所，四川 康定 626000；3.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，四川 成都 610041)

0 引言

梨形蟲病是反芻動物中一種重要的蜱傳寄生蟲病[1-2]。該病的臨床表現(xiàn)多樣，且多呈非特異性[3]，主要以貧血、黃疸、發(fā)燒、血紅蛋白尿、消瘦等為主[4-7]。目前青藏高原地區(qū)，公開報道的會感染牦牛的梨形蟲病病原主要有中華泰勒蟲、呂氏泰勒蟲、環(huán)形泰勒蟲、東方泰勒蟲等[8-10]。在已報道的牦牛泰勒蟲病原中，環(huán)形泰勒蟲對家畜的危害最為嚴重，其次是東方泰勒蟲、中華泰勒蟲等，呂氏泰勒蟲其致病性較強，嚴重者可導致患畜死亡，被稱為“惡性泰勒蟲”[11-13]。道孚縣位于四川西北部，甘孜東北部，整體養(yǎng)殖方式粗放，相關人員防治意識淡薄，牦牛梨形蟲感染情況嚴重，給農(nóng)牧民造成巨大的經(jīng)濟損失。藍嵐等[9]于2018年6-11月，對甘孜18個縣(市)牦牛梨形蟲的感染情況進行調查，采集牦牛全血1 381份，梨形蟲平均陽性率為31.72%，其中道孚縣為28.99%。目前未有對該縣牦牛梨形蟲流形特點的確切報道，因此對道孚縣牦牛梨形蟲流行特點的調查及防治措施的研究很有必要，對梨形蟲病的早期防控具有重要意義。貝尼爾是目前常用的抗梨形蟲藥物[14-15]，療效確切，但副作用較大，且易產(chǎn)生耐藥性。中藥有營養(yǎng)和藥物的雙重作用，且具有低殘留、低耐藥性的特點，是首選的綠色獸藥產(chǎn)品[16-18]。本試驗研究了貝尼爾結合中藥方劑、青蒿、百部對牦牛梨形蟲病的防治效果，為牦牛梨形蟲病的防治提供新的途經(jīng)和有效方法。

1 材料與方法

1.1 牦牛血樣采集

2019年4月、5月、6月、7月、9月、10月，自道孚縣每月定點采集牦牛全血173份，標記時間、年齡、體重，裝于一次性真空抗凝管置冰盒帶回實驗室檢測。所有的血樣均放在-20℃冰箱保存。

1.2 蜱蟲采集

于2019年4月、5月、6月、7月、9月、10月采集牦牛血樣時，采集血樣的牦牛體表如有蜱，采集后裝入收集管，放入75%酒精溶液中，并置于4℃冰箱保存待檢。

1.3 試驗藥物

貝尼爾(購于四川恒通動物制藥有限公司，批號 20180901)，中藥購自中藥房。

1.4 牦牛梨形蟲的分子檢測

1.4.1 全血總 DNA 提取

采用酚-氯仿法提取牦牛全血總 DNA。

1.4.2 18S rRNA 引物的設計

采用以18S RNA為靶基因的梨形蟲巢式 PCR 方法進行檢測。引物信息為外上游引物:GATAACCGTGCTAATTGTAGG，外下游引物:ATCGTCTTCGATCCCCTAACT，擴增片段大小為 843 bp；內上游引物:AATTGTAGGGCTAATACATGTTCG，內下游引物:GAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGC，擴增片段大小為 760 bp，靶基因 18SrRNA。

1.4.3 蟲種鑒定

隨機挑選部份牦牛梨形蟲核酸陽性樣本共計38份的PCR產(chǎn)物送生工(上海)測序。通過NCBI上的BLAST對序列進行比對；采用MEGA 7軟件以Neighbor-Joining法(Bootstrap值為1000)基于梨形蟲序列構建系統(tǒng)進化樹，運用Lasergene 7.0軟件對所測得的序列進行同源性比對分析，根據(jù)構建的進化樹及同源性分析結果鑒定梨形蟲蟲種。

1.5 媒介蜱的形態(tài)學鑒定

采用體式顯微鏡對蜱初步進行形態(tài)學鑒定。

1.6 中藥防治研究

選擇有梨形蟲感染，年齡、體型相似的牦牛35頭，隨機分為5組，每組4～10頭。藥物組1:貝尼爾結合中藥方劑，貝尼爾，3 mg/(kg體重)，臨用前配成5%～7%溶液，肌注；中藥方劑，秦艽散加減方:秦艽30 g、當歸25 g、赤芍 25 g、瞿麥20 g、車前子20 g、焦梔子20 g、大黃20 g、茯苓 20 g、淡竹葉15 g、燈心草15 g、川楝子18 g、甘草20 g，500 mL/頭，灌服，1次/d，連續(xù)給藥3 d。同時進行體外滅蜱。藥物組2:百部，25～30 g/頭，粉為細末，拌料喂。同時進行體外滅蜱。藥物組3:青蒿藥液，60 g/頭，灌服。同時進行體外滅蜱。陽性藥物組:貝尼爾，肌注，3～5 mg/kg，臨用前配成 5%～7% 溶液。同時進行體外滅蜱?？瞻捉M:進行體外滅蜱。用藥前及用藥后50 d，稱重并采集牦牛血液進行血常規(guī)檢測，對梨形蟲病原進行檢測，分析中藥防治效果。

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結果

2.1 道孚縣牦牛梨形蟲整體感染情況

采集血樣173份，經(jīng)巢式PCR擴增其18S rRNA部分基因序列，其中有59份樣本擴增出目的條帶，梨形蟲平均陽性率為34.10%。部分樣本PCR電泳結果，如圖1所示。

M—D2000 DNA Marker；2—陽性對照；1—陰性對照(去離子水)；3～13—牦牛全血樣本

2.2 不同月份牦牛梨形蟲的感染情況

定點對道孚縣進行為期 6 個月的跟蹤調查，發(fā)現(xiàn)各月份均有梨形蟲感染，4月、5月、6月、7月、9月、10月平均陽性率分別為:28.00%(25/7)、66.67%(15/10)、51.02%(49/25)、34.62%(26/9)、14.63%(41/6)、11.76%(17/2)。5月、6 月牦牛梨形蟲陽性率均顯著高其高于其他月份(P<0.05)，之后成下降趨勢，見圖2，圖2中所標字母相異(a～c)表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 牦牛感染梨形蟲的季節(jié)動態(tài)

2.3 不同年齡組牦牛梨形蟲的感染情況

各個年齡段梨形蟲陽性率也均不相同。犢牦牛組(0～2 歲)梨形蟲平均陽性率為 34.48%(29/10)，青年牦牛組(2～5 歲)為 45.78%(83/38)，成年牦牛組(5 歲以上)為 18.03%(61/11)。由圖3可知，青年組牦牛梨形蟲陽性率最高，顯著高于犢牦牛組和成年組(P<0.05)。成年組牦牛梨形蟲陽性率最低，顯著低于犢牦牛組和青年組(P<0.05)。表明青年組牦牛(2～5歲)最易感染牦牛梨形蟲病。

圖3 不同年齡組牦牛梨形蟲的感染情況

2.4 不同體重牦牛梨形蟲的感染情況

對感染梨形蟲牦牛的體重進行分析。小于 100 kg、100～200 kg及大于 200 kg的牦牛梨形蟲陽性率分別為:42.11%(95/40)、28.57(63/18)、6.67%(15/1)。小于 100 kg、100～200 kg 的牦牛梨形蟲陽性率均顯著高于 200 kg 以上的牦牛(P<0.05)，感染梨形蟲的牦牛體重明顯下降，如圖4所示。

圖4 不同體重牦牛梨形蟲的感染情況

2.5 牦牛梨形蟲蟲種檢測結果

從牦牛梨形蟲陽性樣本中挑選 38 份樣本PCR產(chǎn)物測序鑒定蟲種，鑒定蟲種1個，均為中華泰勒蟲?；诶嫘蜗x18SrRNA基因序列建立進化樹進行牦牛梨形蟲蟲種鑒定。由圖5可見，中華泰勒蟲大枝包括道孚檢測出的中華泰勒蟲蟲株 38 株及Genback 中已發(fā)表的甘肅、河南分離株(EU274472.1、KF559355.1、KX115427.1)，其又分為兩小枝，其中一支為檢測出的中華泰勒蟲蟲株 33 株(Yak-32、6-7)與已發(fā)表的甘肅、河南分離株(EU274472.1、KF559355.1、KX115427.1)，另一支為檢測出的其他中華泰勒蟲蟲株5株(5-2、6-13、6-4、5-1、5-3)。

將檢測到的蟲株在 MegAlign 軟件上進行同源性比對分析，測出的中華泰勒蟲之間的同源性為 94.20%～100.00%，與已發(fā)表的蟲株(EU274472.1、KF559355.1、KX115427.1)之間的同源性為 94.50%～100.00%。

2.6 蜱蟲形態(tài)學鑒定結果

共采集到蜱蟲199 只，經(jīng)形態(tài)學鑒定，均為微小扇頭蜱，如圖6所示。

Yak-32—中華泰勒蟲32個樣本序列；▲—其他樣本序列；■—已發(fā)表的中華泰勒蟲蟲株

A—微小扇頭蜱背面；B—微小扇頭蜱腹面

2.7 中藥防治效果觀察

2.7.1 中藥防治對牦牛梨形蟲感染情況的影響

對用藥前后牦牛梨形蟲感染情況進行檢測。由表1可知，空白組牦牛梨形蟲陽性率為100%，各藥物組梨形蟲陽性率均呈下降趨勢；藥物組 1、2牦牛梨形蟲陽性率與陽性藥物組相比有所降低。

2.7.2 中藥防治對牦牛體重的影響

對上述有梨形蟲感染的35頭牦牛進行防治，由表2可知，各藥物組牦牛的體重均有增加，陽性藥物組、藥物組1、2、3 牦牛AG、ADG均比空白組高。藥物組1、2牦牛AG、ADG顯著高于陽性藥物組和空白組(P<0.05)。藥物組3牦牛AG高于陽性藥物組和空白組，但差異不顯著；ADG顯著高于空白組(P<0.05)，較高于陽性藥物組，差異不顯著。

表1 中藥防治對牦牛梨形蟲感染情況的影響

表2 中藥防治對牦牛體重的影響

2.7.3 中藥防治對牦牛 RBC、HGB 的影響

用藥前后對試驗組35頭牦牛血液進行血常規(guī)檢測，用藥前10頭牦牛 RBC、HGB低于參考值。由表3可知，各用藥組牦牛RBC、HGB均有升高，陽性藥物組和藥物組1、2、3牦牛RBC、HGB均達到參考值；空白組牦牛RBC未達到參考值，HGB達到參考值。

表3 中藥防治對牦牛RBC、HGB的影響

3 討論

近年來，陸續(xù)有關于青藏高原地區(qū)牦牛感染梨形蟲的報道，但目前為止，對牦牛感染梨形蟲規(guī)律的確切報道較少。本試驗正是基于這一現(xiàn)狀，2019年4月、5月、6月、7月、9月、10月定點對道孚縣牦牛進行為期6個月的跟蹤調查，首次分析不同月份、年齡段及體重牦牛梨形蟲的感染情況，為道孚縣牦牛梨形蟲病的防治提供依據(jù)。

18S rRNA具有保守性和高變性，還可對感染蟲種進行鑒定，在梨形蟲檢測中廣泛應用且效果良好[19，21]。本實驗采用以18S rRNA 為靶基因的梨形蟲巢式PCR方法，并通過構建系統(tǒng)進化樹及同源性分析，對四川省道孚縣牦牛梨形蟲病原及蟲種進行檢測。

本次調查顯示道孚縣牦牛梨形蟲陽性率為34.10%，道孚縣平均海拔約3 245 m，為半農(nóng)半牧業(yè)縣，與純牧業(yè)縣相比，灌木叢較多，良好的自然環(huán)境及較高的生物多樣性，為蜱蟲提供了適宜的環(huán)境條件，增加了蜱侵襲牦牛，傳播梨形蟲病的概率。5-6月份為感染高峰期，梨形蟲是一種由蜱傳播的血液原蟲病[20]，所以其感染率與蜱蟲的活動規(guī)律密切相關。本實驗將采集到的蜱蟲進行形態(tài)學鑒定，均為微小扇頭蜱。微小扇頭蜱在我國分布廣泛，主寄生于大家畜體表，如黃牛、牦牛、綿羊等[21]，主要生活在農(nóng)區(qū)，氣候溫和，雨量充沛的季節(jié)蜱蟲活躍度開始增高。呈季節(jié)消長性，一二月寄生數(shù)量不多，3月開始數(shù)量逐漸增多，直到6月達到最高峰，以后數(shù)量又逐漸減少，但終年都存在[22]。道孚縣春夏不分明，冬長夏短，冬寒干燥，五六月份氣溫開始升高，降水量、植被增多，蜱蟲開始活躍。本實驗牦牛感染梨形蟲的季節(jié)動態(tài)與微小扇頭蜱活動季節(jié)趨于一致。本實驗梨形蟲青年組牦牛(2～5歲) 最易感染中華泰勒蟲病，與劉道鑫等[23]不同年齡階段牦牛泰勒蟲病的調查結果:2～3歲牦牛最易感染泰勒蟲病，趨于一致，應注意該年齡段牦牛梨形蟲病的防控。本次檢測顯示優(yōu)勢蟲種為中華泰勒蟲，與藍嵐等[9]對四川甘孜進行的牦牛梨形蟲感染情況調查結果:優(yōu)勢蟲種為中華泰勒蟲與呂氏泰勒蟲；以及鐘維等[10]對四川省阿壩州5個縣進行的牦牛梨形蟲檢測結果:感染蟲種均為中華泰勒蟲，趨于一致。本次檢測牦牛均未發(fā)現(xiàn)有明顯的臨床癥狀，說明中華泰勒蟲為溫和型泰勒蟲[24]，裂殖體并不起主要作用。但是比較不同體重牦牛梨形蟲的感染情況，結果顯示，感染梨形蟲的牦牛體重明顯下降，除此之外對有梨形蟲感染的 35 頭牦牛進行血常規(guī)檢測，10 頭存在貧血現(xiàn)象。梨形病感染會導致牦牛生長發(fā)育遲緩、產(chǎn)肉量下降等[25-26]，大大降低了農(nóng)牧民的經(jīng)濟收入，所以做好梨形蟲病的防治工作對農(nóng)牧民增收有重要的意義。

目前防治梨形蟲病多采用貝尼爾、鹽酸吖啶磺等，但其副作用大，病牛體質恢復較慢且均需肌肉或靜脈注射，一般需要專業(yè)獸醫(yī)人員進行操作，目前甘孜牧區(qū)保定設施及基層獸醫(yī)人員缺乏，臨床普及不易。中藥副作用小，功效獨特，諸多藥物具有增強免疫力、抗菌驅蟲、保健防病的作用[27-28]，對牦牛感染梨形蟲后的體質有改善作用。且中藥價格便宜，多采用拌料或灌服，農(nóng)牧民自己即可操作，較易普及。栗明來等[29]用三氮瞇結合中藥方劑同時應用，取得確實的療效。王守文等[30]對中西藥治療羊梨形蟲病效果進行對比，三氮脒治愈率為 73.5%，采用中西藥物結合治療，療效確實顯著，治愈率達97.6%。國內報道運用中西藥結合治療梨形蟲病的越來越多。秦艽散具有祛瘀止血，清熱利尿的功能，主治膀胱積熱，努傷尿血[31]，本實驗減去秦艽散中黃芩、紅花、蒲黃、大黃、白芍、天花粉，加上赤芍、連翹、茯苓、燈心草、川楝子等清熱涼血、清熱解毒、利水利尿、驅蟲藥物，組成具有清熱利尿、祛瘀止血、補血和中、補氣、驅蟲、健脾生血、增強體質功效的中藥方劑。將該方劑結合貝尼爾對牦牛梨形蟲進行防治，用藥后牦牛梨形蟲陽性率下降，牦牛 AG、ADG 顯著高于陽性藥物組和空白組，且改善了牦牛的貧血現(xiàn)象，說明中西藥結合防治牦牛梨形蟲病可大大提高防治效果。百部具有殺蟲的功效[31]，青蒿具有殺原蟲、清熱解毒的功效[31]。鄭海等[32]研究了中藥百部對羊泰勒焦蟲病的防治效，發(fā)現(xiàn)其治療效果優(yōu)于貝尼爾，而預防效果相同。丁景昌等[33]采用用青篙對牛雙芽巴貝斯焦蟲病進行治療，結果顯示，其可直接殺滅雙芽巴貝斯焦蟲，屬于高效抗雙芽巴貝斯焦蟲的藥物。本實驗分別采用百部及青蒿對牦牛梨形蟲病進行防治，各藥物組梨形蟲陽性率均呈下降趨勢。百部組牦牛梨形蟲陽性率與陽性藥物組相比有所降低，牦牛 AG、ADG 顯著高于陽性藥物組和空白組(P<0.05)。青蒿組牦牛 AG 高于陽性藥物組和空白組，但差異不顯著；ADG 顯著高于空白組(P<0.05)，較高于陽性藥物組，差異不顯著。兩組牦牛貧血現(xiàn)象均有改善。說明百部與青蒿均有防治牦牛梨形蟲病的效果，百部可作為高效防治牦牛梨形蟲病的藥物。

4 結論

本試驗首次對道孚縣牦牛梨形蟲不同月份、年齡段及體重的感染情況進行調查，道孚縣牦牛梨形蟲感染率較高，不同月份、年齡段、體重間存在差異，優(yōu)勢蟲種為中華泰勒蟲，主要傳播媒介為微小扇頭蜱。中西藥結合防治牦牛梨形蟲病效果顯著，百部與青蒿均有防治牦牛梨形蟲病的效果。百部及青蒿防治梨形蟲病，使用方便，農(nóng)牧民自己即可操作，可減輕大群投藥時的勞動強度，易推廣。由于試驗樣本數(shù)太少，因此對于百部及青篙防治梨形蟲病的有效成分及其藥理作用機制尚待進一步深入研究。