李永真，王志慧,2，李 娜，宋 穎，韓正華，千新來，原志慶，陸漫漫，李思琦

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

腫瘤內(nèi)部缺氧是實(shí)體瘤的共同特征，是惡性表型發(fā)展的重要微環(huán)境因素。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)是介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)缺氧反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子[1]。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡、增殖、血管生成有重要的調(diào)節(jié)功能，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、化學(xué)治療耐藥也起著重要作用。有研究表明，磷脂酶C-ε通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MEK)/細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(cell signal regulated kinase，ERK)和HIF-1α途徑調(diào)節(jié)前列腺癌的代謝和轉(zhuǎn)移[2]。在卵巢癌中，鹽誘導(dǎo)激酶2通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，促進(jìn)糖酵解[3]。HIF-2α為HIF家族重要成員，與HIF-1α在結(jié)構(gòu)上有很大的一致性，而且二者識(shí)別并結(jié)合的DNA也相同，目前的文獻(xiàn)對(duì)HIF-1α研究較多，對(duì)HIF-2α與腫瘤的關(guān)系研究相對(duì)較少。本課題組前期研究表明，HIF-2α在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中高表達(dá)，并與乳腺癌增殖、侵襲和多藥耐藥的發(fā)生密切相關(guān)[4-5]，而PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信號(hào)通路對(duì)缺氧誘導(dǎo)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞中HIF-2α表達(dá)的影響尚不明確。本研究通過研究抑制PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信號(hào)通路對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中HIF-2α表達(dá)的影響，旨在為乳腺癌的治療尋找新的途徑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源人低侵襲乳腺癌MCF-7細(xì)胞由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心提供。

1.2 主要試劑和儀器氯化鈷(cobalt chloride，CoCl2)購自美國Sigma公司，引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，HIF-2α兔抗人多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，PI3K/Akt抑制劑LY294002、MEK/ERK1/2抑制劑U0126、磷酸化ERK1/2(phosphorylation ERK1/2，p-ERK1/2)和磷酸化Akt(phosphorylated Akt，p-Akt)抗體購自美國Cell Singaling Technology公司，增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購自上海碧云天生物有限公司，TRIzol試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative fluorescence polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司，二辛可寧酸(bicinchonininc acid，BCA)購自美國Thermo公司，Tris 緩沖生理鹽水( Tris-buffered saline and Tween-20，TBST) 購自寧波億諾醫(yī)藥科技有限公司；熒光顯微鏡購自日本Nikon公司，Step One熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和分組將乳腺癌 MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)24 h后，分為常氧組、缺氧組、缺氧+低劑量LY294002組、缺氧+高劑量LY294002組、缺氧+低劑量U0126組、缺氧+高劑量U0126組。常氧組細(xì)胞更換為含生理鹽水的RPMI 1640培養(yǎng)基，缺氧組細(xì)胞更換為含100 μmol·L-1CoCl2的RPMI 1640 培養(yǎng)基，缺氧+低劑量LY294002組更換為含 100 μmol·L-1CoCl2和 4 μmol·L-1LY294002的RPMI 1640 培養(yǎng)基，缺氧+高劑量LY294002組更換為含100 μmol·L-1CoCl2和40 μmol·L-1LY294002的RPMI 1640 培養(yǎng)基，缺氧+低劑量U0126組更換為含100 μmol·L-1CoCl2和 2 μmol·L-1U0126的 RPMI 1640 培養(yǎng)基，缺氧+高劑量U0126更換為含 100 μmol·L-1CoCl2和8 μmol·L-1U0126的RPMI 1640 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中HIF-2α mRNA的表達(dá)取各組繼續(xù)培養(yǎng)3 h后的MCF-7細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，使用qRT-PCR試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中HIF-2α mRNA的表達(dá)量，HIF-2α上游引物序列：5′-TGAAAACGGAGTCCGAAGCC-3′，下游引物序列：5′-GTGGCTGACTTGAGGTTGA-3′，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)為40。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算HIF-2α的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中HIF-2α、p-Akt和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)收集各組繼續(xù)培養(yǎng)3 h后MCF-7的細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌并重懸后離心，取上清液加入放射免疫沉淀裂解液輕搖重懸后冰上孵育 30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白上清經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用50 g·L-1脫脂奶粉封閉 90 min，加入HIF-2α(1100)、p-ERK1/2(1100)、p-Akt(1200)兔抗人一抗于4 ℃下孵育過夜，TBST洗滌3次×10 min，硝酸纖維素膜加入羊抗兔二抗(12 000)，室溫孵育90 min，TBST洗滌3次×10 min，按照ECL試劑盒說明書進(jìn)行操作，X線片曝光、顯影、定影。內(nèi)參蛋白為GAPDH，使用 Image J 軟件分析各蛋白對(duì)應(yīng)的灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 各組MCF-7細(xì)胞中HIF-2α mRNA相對(duì)表達(dá)量比較常氧組、缺氧組、缺氧+低劑量LY294002組、缺氧+高劑量LY294002組、缺氧+低劑量U0126組、缺氧+高劑量U0126組MCF-7細(xì)胞中HIF-2α mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.913±0.252、1.374±0.188、0.731±0.111、0.613±0.133、0.892±0.142、0.545±0.174，各組MCF-7細(xì)胞中HIF-2α mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=74.237，P<0.05)。缺氧組MCF-7細(xì)胞中HIF-2α mRNA相對(duì)表達(dá)量高于常氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；缺氧+低劑量LY294002組、缺氧+高劑量LY294002組、缺氧+低劑量U0126組、缺氧+高劑量U0126組MCF-7細(xì)胞中HIF-2α mRNA相對(duì)表達(dá)量低于缺氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。缺氧+高劑量LY294002組MCF-7細(xì)胞中HIF-2α mRNA相對(duì)表達(dá)量低于缺氧+低劑量LY294002組，缺氧+高劑量U0126組MCF-7細(xì)胞中HIF-2α mRNA相對(duì)表達(dá)量低于缺氧+低劑量U0126組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組MCF-7細(xì)胞中HIF-2α蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見圖1。常氧組、缺氧組、缺氧+低劑量LY294002組、缺氧+高劑量LY294002組、缺氧+低劑量U0126組、缺氧+高劑量U0126組MCF-7細(xì)胞中HIF-2α 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.924±0.262、1.386±0.342、0.732±0.214、0.572±0.166、0.860±0.322、0.586±0.188，各組MCF-7細(xì)胞中HIF-2α蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=76.438，P<0.05)。缺氧組MCF-7細(xì)胞中HIF-2α 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于常氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；缺氧+低劑量LY294002組、缺氧+高劑量LY294002組、缺氧+低劑量U0126組、缺氧+高劑量U0126組MCF-7細(xì)胞中HIF-2α 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于缺氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。缺氧+高劑量LY294002組MCF-7細(xì)胞中HIF-2α 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于缺氧+低劑量LY294002組，缺氧+高劑量U0126組細(xì)胞中HIF-2α 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于缺氧+低劑量U0126組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1：缺氧組；2：常氧組；3：缺氧+低劑量U0126組；4：缺氧+高劑量U0126組；5：缺氧+低劑量LY294002組；6：缺氧+高劑量LY294002組。

2.3 各組MCF-7細(xì)胞中p-Akt、p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見圖2和表1。各組MCF-7細(xì)胞中p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=86.542、88.460，P<0.05)。缺氧組MCF-7細(xì)胞中p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于常氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。缺氧+低劑量LY294002組、缺氧+高劑量LY294002組、缺氧+低劑量U0126組、缺氧+高劑量U0126組MCF-7細(xì)胞中p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于缺氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。缺氧+高劑量LY294002組MCF-7細(xì)胞中p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于缺氧+低劑量LY294002組，缺氧+高劑量U0126組MCF-7細(xì)胞中p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于缺氧+低劑量U0126組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1：缺氧組；2：常氧組；3：缺氧+低劑量U0126組；4：缺氧+高劑量U0126組；5：缺氧+低劑量LY294002組；6：缺氧+高劑量LY294002組。

表1 各組MCF-7細(xì)胞中p-Akt、p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

乳腺癌是中國女性最常見的惡性腫瘤，也是女性患癌癥死亡的主要原因，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[6-8]。缺氧是實(shí)體瘤的一個(gè)常見特征，與各種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)促進(jìn)其存活的蛋白質(zhì)(如血管生成因子、糖酵解酶和應(yīng)激蛋白)而在缺氧條件下得以存活，大部分腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下生長(zhǎng)快速。HIF是一種異源二聚體，由HIF-α和HIF-β 2個(gè)亞基構(gòu)成。HIF是缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵分子，調(diào)節(jié)特定基因的活化，介導(dǎo)許多組織對(duì)缺氧的適應(yīng)，然而缺氧反應(yīng)途徑復(fù)雜，許多機(jī)制尚不清楚。HIF-2α在缺氧條件下在人體內(nèi)廣泛存在，其表達(dá)有組織特異性，目前在結(jié)直腸癌細(xì)胞[9]、肝癌細(xì)胞[10]、肺癌細(xì)胞[11]等多種惡性腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)HIF-2α高表達(dá)。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，HIF-2α在乳腺癌組織中高表達(dá)，而且通過小干擾RNA干擾HIF-2α的表達(dá)抑制了乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖和侵襲能力[4-5]。

PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其通路中一些成分的突變可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化，且其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)激活狀態(tài)與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成及存活等有關(guān)。研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活與腫瘤的侵襲性有關(guān)[12]。生長(zhǎng)因子激活的受體酪氨酸激酶?jìng)鲗?dǎo)通路和多種細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)[13]；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的上游激酶是其中重要的一環(huán)，具有酪氨酸、蘇氨酸激酶活性，MEK/ERK1/2信號(hào)通路的異?；罨餭-fos、c-Jun,Elk-1、c-myc等基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞喪失凋亡和分化的能力，促使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化并異常增殖，產(chǎn)生腫瘤，并能進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。COSTA等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路在乳腺癌中的活化率高達(dá)70%。CHEN等[15]研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信號(hào)通路可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。本研究通過觀察抑制PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信號(hào)通路對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中HIF-2α表達(dá)的影響，探討PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信號(hào)通路在乳腺癌中對(duì)HIF-2α表達(dá)的調(diào)控作用，研究結(jié)果表明，LY294002和U0126這2種抑制劑均能明顯抑制缺氧誘導(dǎo)的HIF-2α的表達(dá)，且LY294002能夠抑制缺氧狀態(tài)下乳腺癌MCF-7細(xì)胞中p-Akt和p-ERK1/2的磷酸化水平，U0126亦能夠抑制缺氧狀態(tài)下乳腺癌MCF-7細(xì)胞中p-Akt和p-ERK1/2的磷酸化水平，并且抑制效果均呈劑量依賴性，說明在缺氧條件下抑制PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信號(hào)通路可以明顯抑制HIF-2α的表達(dá)。JIANG等[16]研究顯示，在喉癌組織中PI3K/Akt信號(hào)通路與HIF-1α的表達(dá)相關(guān)；另有研究報(bào)道，紅景天苷通過PI3K/Akt信號(hào)通路抑制HIF-1α的表達(dá)，減輕阿霉素誘導(dǎo)的局部性腎小球硬化癥[17]；以上研究均提示PI3K/Akt信號(hào)通路與HIF的表達(dá)相關(guān)。本研究與以上研究的結(jié)果[16-17]相符，本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了乳腺癌中PI3K/Akt信號(hào)通路與HIF-2α的正向調(diào)控關(guān)系。

綜上所述，在缺氧條件下被激活的PI3K/AKT和MEK/ERK1/2信號(hào)通路對(duì)HIF-2α具有正向調(diào)節(jié)作用，PI3K/AKT和MEK/ERK1/2信號(hào)通路可能是缺氧誘導(dǎo)HIF-2α表達(dá)的上游信號(hào)通路，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。本研究結(jié)果為治療乳腺癌提供了新的途徑，但其詳細(xì)調(diào)控機(jī)制及通路中諸多分子靶點(diǎn)仍是下一步研究的方向。