查 青，陳燕妮，晁 旭,2

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 西安 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院科研科，陜西 咸陽 712000)

肝細(xì)胞肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在各類腫瘤中位居第6，病死率位居第4，是全球第4大癌癥相關(guān)死亡原因[1]。目前，我國肝癌發(fā)病率在各類腫瘤中位居第2，死亡人數(shù)約占全球的51%[2]。肝癌因其發(fā)病隱匿、肝臟代償能力強、發(fā)現(xiàn)時多為中晚期而導(dǎo)致預(yù)后不良，病死率較高。肝癌發(fā)生的主要危險因素有病毒感染、代謝性疾病(如脂肪肝、糖尿病、酒精性肝疾病等)及其他因素(如黃曲霉毒素、馬兜磷酸暴露等)。目前，早期肝癌可通過局部消融、手術(shù)切除或肝移植等方法進行治療，以導(dǎo)管為基礎(chǔ)的局部區(qū)域治療適用于中期癌癥患者[3]。中西醫(yī)結(jié)合是我國的特色治療方法，在肝癌的治療中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，肝癌術(shù)后及放射治療和化學(xué)治療后聯(lián)合中醫(yī)藥治療具有驅(qū)邪扶正、散結(jié)消徵、提高正氣、提高患者生存質(zhì)量、減少放化療不良反應(yīng)等作用。因此，探尋中藥在肝癌治療中的作用及機制具有重要意義。

土貝母為葫蘆科植物土貝母的干燥塊莖，其味苦，性微寒，能夠解毒、消腫、散結(jié)，常用于治療乳癰、痰核、瘰疬等疾病[4]；《本草從新》中記載其可“治外科痰毒”[5]。因此，土貝母被長期應(yīng)用于各類腫瘤的治療?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，其有效提取物土貝母苷甲對肝癌、人乳腺腫瘤、口腔鱗狀細(xì)胞癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等各類腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，土貝母含藥血清能夠有效抑制人肝癌細(xì)胞7404增殖，并促進其凋亡；土貝母含藥血清作用于7404細(xì)胞后能夠提高細(xì)胞中caspase-3的表達，預(yù)示著其作用機制可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)[6-9]?；谕霖惸傅那捌谘芯拷Y(jié)果，本研究致力于探討土貝母在小鼠體內(nèi)能否有效抑制肝癌的生長及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性昆明小鼠30只，6周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。

1.2 細(xì)胞、試劑與儀器H22細(xì)胞株購自上海茂科生物有限公司；土貝母購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院；Ki67、caspase-1、caspase-3、caspase-9抗體購自武漢賽維爾科技有限公司；GREEN-30T超純水機購自南京易普易達科技發(fā)展有限公司，電子天平購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，DYCZ-24DN雙垂直電泳儀購自北京六一儀器廠，D1008E掌上離心機購自武漢賽維爾科技有限公司，AX-Ⅱ暗匣購自廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司，MS-PB磁力攪拌器、TSY-B脫色搖床均購自武漢賽維爾科技有限公司，小鼠灌胃針購自深圳市恒銘金屬制廠，一次性注射器購自陜西龍康鑫醫(yī)療器械有限公司，1300 SERIES A2超凈工作臺購自德國賽默飛世爾科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 瘤細(xì)胞懸液的制備將1 mL H22凍存細(xì)胞于37 ℃恒溫水浴箱中快速溶解，溶解后快速離心棄上清，加入10 mL 達爾伯克尹格爾完全培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻后接種于培養(yǎng)皿中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時觀察，當(dāng)細(xì)胞生長至密度達80%～90%時進行傳代，傳2代后收集細(xì)胞，以磷酸鹽緩沖液稀釋為 1×1011L-1瘤細(xì)胞懸液，備用。取2只小鼠于右下腹部腹中線旁1 cm處消毒，將配置的瘤細(xì)胞混懸液0.1 mL(約 1×107個瘤細(xì)胞)注射入小鼠腹腔內(nèi)，觀察小鼠腹水生長情況。1周后觀察到小鼠腹部膨隆，按之柔軟后用注射器抽取腹水。小鼠腹部皮膚消毒，無菌抽取乳白色腹水，離心后棄上清液，鏡下觀察并確認(rèn)為腫瘤細(xì)胞后，以生理鹽水將瘤細(xì)胞稀釋為1×1011L-1瘤細(xì)胞懸液，備用。

1.3.2 藥液制備根據(jù)《中國藥典》中藥制劑通則，將100 g土貝母生藥于1 500 mL蒸餾水中浸泡2 h，武火煮沸轉(zhuǎn)用文火熬煮1 h，4層紗布分離藥液，再加入1 500 mL蒸餾水繼續(xù)加熱，武火煮沸，文火熬煮40 min，4層紗布過濾藥液，棄藥渣，將2次藥液合并收集，將藥液濃縮至2.0 g·mL-1,取1/2備用，剩余的藥液用蒸餾水分別稀釋為1.0、0.5 g·mL-1，置于4 ℃冰箱備用。給藥前37 ℃水浴加熱。

1.3.3 實驗分組及干預(yù)措施取30只小鼠適應(yīng)性生長1周后隨機分為空白對照組、模型組、高濃度組、中濃度組和低濃度組，每組6只，分籠飼養(yǎng)并標(biāo)記；局部消毒后，模型組和高、中、低濃度組小鼠右前腋窩皮下接種瘤細(xì)胞懸液0.1 mL(約1×107個瘤細(xì)胞)制備肝癌小鼠模型，空白對照組小鼠皮下注射0.1 mL生理鹽水。造模次日早上，高濃度組、中濃度組和低濃度組小鼠分別灌胃給予2.0、1.0、0.5 g·mL-1的土貝母水提液(0.2 mL·10 g-1)，空白對照組和模型組小鼠給予相同體積的蒸餾水；每日1次，共給藥30 d。

1.3.4 小鼠進食量測定實驗過程中觀察小鼠存活狀態(tài)、精神狀態(tài)、步態(tài)及毛色等指標(biāo)；定量給予食物200 g，每隔2日稱量剩余食物質(zhì)量，并加至200 g，通過食物消耗量計算每日每只小鼠的進食量。

1.3.5 小鼠體質(zhì)量及腫瘤體積測量待腫瘤長出后每隔2日稱小鼠未灌胃前體質(zhì)量，使用電子游標(biāo)卡尺測出小鼠瘤體的長徑及短徑，計算小鼠腫瘤體積。腫瘤體積=1/2×Dmax×(Dmin)2，Dmax、Dmin分別為皮下腫瘤的長徑與短徑[10]。

1.3.6 樣品采集各組小鼠完成給藥后禁食不禁水15 h，頸椎脫臼處死小鼠，置于干凈操作臺上剝離瘤體，生理鹽水沖洗干凈，將其分為2份，1份置于-80 ℃冰箱保存，另1份置于100 g·L-1多聚甲醛溶液中固定。

1.3.7 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法觀察腫瘤細(xì)胞的病理學(xué)變化取腫瘤組織，常規(guī)石蠟包埋切片，厚度4～6 μm，HE染色后光鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)。

1.3.8 免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中Ki67的表達腫瘤組織切片后，將包埋切片按照二步法免疫組織化學(xué)試劑盒說明進行檢測。光鏡下拍照并應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0進行分析，細(xì)胞核呈棕黃色為陽性細(xì)胞，細(xì)胞核呈藍色為其他細(xì)胞，計數(shù)每張照片中陽性細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，并計算陽性細(xì)胞百分比。陽性細(xì)胞百分比=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.9 Western blot法檢測腫瘤組織中caspase-1、caspase-3和caspase-9蛋白表達取各組肝癌組織，組織勻漿機進行勻漿，RIPA細(xì)胞裂解液進行裂解，提取總蛋白，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉，TBST洗脫3次，每次10 min，隨后將條帶放入10 mL的一抗4 ℃過夜，敷二抗后暗室曝光。以β-actin為內(nèi)參，分析膠片灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參條帶的灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 H22荷瘤小鼠的一般情況造模后小鼠一般狀態(tài)良好，隨著給藥及腫瘤增長，荷瘤小鼠均出現(xiàn)活動受限，毛色粗糙暗淡，其中模型組小鼠由于腫瘤體積較大，其活動明顯受限，其余各腫瘤組荷瘤小鼠活動輕度受限。

2.2 5組小鼠每日進食量及體質(zhì)量比較結(jié)果見表1。模型組及低、中、高濃度組小鼠每日進食量均少于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低、中、高濃度組小鼠每日進食量均多于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低濃度組小鼠每日進食量多于高濃度組和中濃度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中濃度組與高濃度組小鼠每日進食量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

模型組、低濃度組、高濃度組與空白對照組小鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；中濃度組小鼠體質(zhì)量低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低、中、高濃度組小鼠體質(zhì)量均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低、中、高濃度組小鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 5組小鼠每日進食量及體質(zhì)量比較

2.3 4組荷瘤小鼠腫瘤體積變化結(jié)果見表2。低濃度組、中濃度組、高濃度組小鼠腫瘤體積均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；低濃度組、中濃度組、高濃度組小鼠腫瘤體積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 4組荷瘤小鼠腫瘤體積比較

2.4 4組荷瘤小鼠腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變結(jié)果見圖1。模型組小鼠腫瘤細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見明顯的細(xì)胞凋亡、壞死、腫脹。與模型組比較，高、中、低濃度組小鼠均出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞腫脹、細(xì)胞數(shù)量減少、間隙增寬及不同程度的壞死和凋亡。

A、A1:模型組；B、B1：高濃度組；C、C1：中濃度組；D、D1:低濃度組;圖A、B、C、D放大200倍；圖A1、B1、C1、D1放大400倍。

2.5 4組荷瘤小鼠腫瘤組織中Ki67的表達結(jié)果見圖2。模型組、高濃度組、中濃度組、低濃度組小鼠腫瘤組織中Ki67陽性表達率分別為(62.10±16.59)%、(26.80±16.72)%、(41.76±2.98)%、(18.68±16.83)%。高濃度組、中濃度組、低濃度組小鼠腫瘤組織中Ki67陽性表達率均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；低濃度組小鼠腫瘤組織中Ki67陽性表達率低于中濃度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高濃度組與低濃度組、中濃度組小鼠腫瘤組織中Ki67陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

A:模型組;B：高濃度組;C：中濃度組;D:低濃度組。

2.6 4組荷瘤小鼠腫瘤組織中caspase-1、caspase-3、caspase-9蛋白的表達結(jié)果見圖3和表3。低濃度組、中濃度組、高濃度組小鼠腫瘤組織中caspase-1、caspase-3、caspase-9蛋白相對表達量均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。中濃度組、高濃度組小鼠腫瘤組織中caspase-1、caspase-3蛋白相對表達量低于低濃度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高濃度組小鼠腫瘤組織中caspase-9蛋白相對表達量低于低濃度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中濃度組小鼠腫瘤組織中caspase-9蛋白相對表達量與低濃度組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。高濃度組小鼠腫瘤組織中caspase-3蛋白相對表達量低于中濃度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高濃度組與中濃度組小鼠腫瘤組織中caspase-1、caspase-3蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 4組荷瘤小鼠腫瘤組織中caspase-1、caspase-3、caspase-9蛋白相對表達量比較

3 討論

肝細(xì)胞癌是一種發(fā)病率高、病死率高的惡性腫瘤，在中醫(yī)屬“積聚”、“臌脹”等范疇。土貝母是我國傳統(tǒng)中藥材，具有散結(jié)消徵作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，土貝母具有抗炎和抗癌作用，對免疫功能也有多方面的作用。土貝母能夠散結(jié)消癰、扶正祛邪，從而抑制肝癌的增殖。

Ki67可以體現(xiàn)腫瘤的增殖活性，其表達水平的改變能夠反映腫瘤進展情況，是判斷腫瘤治療效果的重要指標(biāo)[11]。Ki67作為目前已知增殖能力最強的基因之一，是惡性腫瘤理想的標(biāo)志物[12]。Ki67在細(xì)胞分裂的G0期不表達，在G1期表達水平逐漸上升，M期達到峰值[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，Ki67的陽性表達率與惡性腫瘤的治療難度及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，其陽性表達率越高，治療難度越高，預(yù)后越差；另外，其與惡性腫瘤的病理分級呈正相關(guān)，陽性表達率越高，腫瘤組織分化程度越低，惡性程度越高[14-15]。因此，Ki67陽性表達率可用于評估腫瘤的治療效果。本研究結(jié)果顯示，不同濃度土貝母組小鼠腫瘤組織中Ki67陽性表達率均顯著低于模型組，提示土貝母能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞凋亡是一種程序性死亡，主要表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)斷裂和固縮、凋亡小體形成，而細(xì)胞膜保持完整，并通過周圍巨噬細(xì)胞的吞噬作用被迅速清除，從而避免炎癥反應(yīng)發(fā)生[16-17]。細(xì)胞凋亡主要通過外源性(死亡受體)和內(nèi)源性(線粒體)信號通路被激發(fā)，這2條通路均與caspases級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，caspase是可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡活性的藥物發(fā)展靶標(biāo)[18]。在外源性途徑中，死亡受體激活caspase-8和caspase-10，使其裂解并激活caspase-3和caspase-7；在內(nèi)源性途徑中，線粒體膜被破壞，線粒體蛋白如細(xì)胞色素C被釋放。在凋亡的caspase級聯(lián)反應(yīng)中，釋放的細(xì)胞色素C死亡蛋白酶激活因子1活化caspase-9，活化的caspase-9激活在細(xì)胞凋亡的破壞階段起關(guān)鍵作用的執(zhí)行者caspase-3[19]。在此2種死亡途徑中，凋亡的觸發(fā)均是通過不同信號復(fù)合體內(nèi)啟動子caspase的強制二聚化實現(xiàn)的[18]。Caspase-3位于凋亡通路的下游，是凋亡執(zhí)行子，在內(nèi)源性和外源性通路中最終均通過激活caspase-3而引發(fā)細(xì)胞凋亡[20]。細(xì)胞焦亡是近年來發(fā)現(xiàn)并被證實的一種新型程序性細(xì)胞死亡方式，其過程主要依賴于caspase-1。細(xì)胞焦亡由細(xì)胞內(nèi)炎癥小體及caspase-1介導(dǎo)發(fā)生，伴隨著細(xì)胞膜孔腔形成及炎癥介質(zhì)、電解質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)容物的釋放。炎癥介質(zhì)通過招募免疫細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，細(xì)胞膜內(nèi)外電解質(zhì)失衡產(chǎn)生電化學(xué)反應(yīng)和滲透梯度，水分的進入造成細(xì)胞膜破裂[21]。本研究以細(xì)胞凋亡及細(xì)胞焦亡2條信號途徑為切入點，通過探討細(xì)胞凋亡途徑中caspase-3、caspase-9蛋白表達及細(xì)胞焦亡途徑中caspase-1蛋白表達研究土貝母對H22肝癌小鼠的作用。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠平均進食量下降，體質(zhì)量上升，且增幅較大，主要與腫瘤增長較快有關(guān)；而給予土貝母治療后能夠增加小鼠進食量、降低小鼠體質(zhì)量，主要與抑制小鼠腫瘤增長有關(guān)。模型組小鼠毛色暗淡粗糙，活動受限明顯；與模型組相比，高、中、低濃度組小鼠平均進食量增加，毛色較模型組光滑，活動受限較輕，表明土貝母能明顯改善H22肝癌荷瘤小鼠的生存狀態(tài)。本研究還發(fā)現(xiàn)，30 d 給藥結(jié)束后，低濃度組、中濃度組、高濃度組小鼠腫瘤體積均顯著小于模型組，其中中濃度組小鼠腫瘤體積降低最為明顯，但低濃度組、中濃度組、高濃度組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,表明土貝母能夠有效地抑制腫瘤生長。病理學(xué)結(jié)果顯示，模型組小鼠腫瘤細(xì)胞核大深染，呈腫瘤組織明顯特征，表明肝癌模型建立成功；與模型組相比，各濃度組均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞密度降低、間隙增寬及細(xì)胞腫脹、破裂等特征，且有不同程度的壞死和凋亡區(qū)域，提示土貝母可能會促進癌細(xì)胞的破裂，殺滅腫瘤細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，土貝母能夠降低腫瘤標(biāo)志物Ki67的陽性表達率，且以低濃度組最為明顯，提示土貝母對肝癌的治療效果佳，能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但其表達不呈濃度依賴性，考慮可能與中藥的最佳濃度及中藥作用的多靶點多通路有關(guān)，后期課題組將進一步進行藥物量效關(guān)系及其他藥物靶點相關(guān)性的研究。本研究Western blot結(jié)果顯示，與模型組相比，低濃度組、中濃度組、高濃度組小鼠腫瘤組織中caspase-1、caspase-3、caspase-9蛋白的表達量顯著上調(diào)，且存在一定的劑量依賴性，其中低濃度組上調(diào)最為顯著，表明土貝母可能通過激活細(xì)胞凋亡及細(xì)胞焦亡途徑實現(xiàn)抗腫瘤作用。

綜上所述，土貝母具有抗腫瘤作用，能明顯抑制腫瘤生長，降低腫瘤標(biāo)志物Ki67的陽性表達率，其作用機制可能是通過上調(diào)caspase-1促進細(xì)胞焦亡及上調(diào)caspase-3、caspase-9促進細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抗腫瘤作用，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機制可能與線粒體相關(guān)的內(nèi)源性死亡途徑相關(guān)，但其機制尚需進一步深入研究。