■王智勇 曾建國(guó) 劉 薇*
(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙410128;2.中獸藥湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長(zhǎng)沙410128)
農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第217 號(hào)公告批準(zhǔn)了源自金銀花中的綠原酸作為具有促進(jìn)肉仔雞生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化效率、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力、改善腸道菌群結(jié)構(gòu)等功效的新型飼料添加劑;同時(shí)綠原酸被應(yīng)用于水產(chǎn)飼料行業(yè)也有多年歷史[1]。而異綠原酸在結(jié)構(gòu)上比綠原酸多一個(gè)咖啡?;鶊F(tuán),具有抗氧化、抗炎、抗病毒等重要生物活性,以及調(diào)血脂、抗纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抑制組胺釋放、抑制平滑肌收縮等臨床應(yīng)用價(jià)值[2]。
前期研究發(fā)現(xiàn),天然異綠原酸的來(lái)源十分廣泛,因其屬于縮酚酸,可通過(guò)熱回流提取法、大孔樹(shù)脂吸附法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、酶解法等提取得到;而化學(xué)合成的異綠原酸往往副產(chǎn)物較多且分離困難,其合成工藝也往往成本太高。所以從天然植物中提取異綠原酸仍是研究的主流,但目前針對(duì)異綠原酸的提取工藝研究仍處于相對(duì)薄弱階段。
異綠原酸類(lèi)化合物是經(jīng)植物體內(nèi)有氧呼吸過(guò)程中的莽草酸途徑,由咖啡酸(caffeic acid)與奎尼酸(quinic acid)生成的縮酚酸,屬于二咖啡??鼘幩犷?lèi)化合物。理論上,兩個(gè)咖啡酰以不同的結(jié)構(gòu)方式結(jié)合在奎尼酸上,有6 種同分異構(gòu)體,但至今從天然植物中發(fā)現(xiàn)的二咖啡??鼘幩犷?lèi)化合物只有4種:1,3-二咖啡酰奎尼酸(萊薊素)、3,4-二咖啡??崴幔ó惥G原酸B)、3,5-二咖啡??崴幔ó惥G原酸C)、4,5-二咖啡??崴幔ó惥G原酸A),并且目前研究最多的是后3 種,圖1為異綠原酸A、B、C的結(jié)構(gòu)式。
近年來(lái),異綠原酸的抗炎癥、抗菌、抗病毒、抗氧化、保護(hù)肝臟等生物活性已逐漸被人們所熟知[3-9]。除此之外,國(guó)外的一些研究還發(fā)現(xiàn)異綠原酸具有抗癌、治療急性肺損傷、抗鞭毛蟲(chóng)、抑制遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)錄與翻譯、保護(hù)代謝系統(tǒng)、抑制平滑肌收縮、促凝血、降血壓等臨床藥用價(jià)值。
圖1 異綠原酸A(1)、B(2)、C(3)的結(jié)構(gòu)式
大量研究表明,異綠原酸具有良好的體內(nèi)外抗炎活性。Kimura等[10]研究發(fā)現(xiàn),三種不同異構(gòu)體的異綠原酸能抑制人體外周血多形核白細(xì)胞A23187誘導(dǎo)鈣離子產(chǎn)生白三烯B4,同時(shí)異綠原酸B 又能刺激分泌前列腺素E2,這兩方面作用足以表明異綠原酸具有良好的抗炎活性。楊敏[11]對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎小鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究,發(fā)現(xiàn)分離自苦丁茶中的異綠原酸類(lèi)化合物對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有良好的治療效果。侯彩平[12]利用LPS誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)下斑馬魚(yú)模型,證明異綠原酸A能降低斑馬魚(yú)體內(nèi)一氧化氮和活性氧的產(chǎn)生,緩解卵黃囊水腫和降低斑馬魚(yú)心率,此作用具有濃度依賴(lài)性。異綠原酸A在實(shí)驗(yàn)濃度范圍(5~40 pg/mL)內(nèi)能使CuSO4誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)體內(nèi)測(cè)線巨噬細(xì)胞數(shù)減少,且減少的數(shù)量隨異綠原酸A濃度的升高而增多。倪付勇等[13]的研究發(fā)現(xiàn),異綠原酸A和異綠原酸C能抑制白細(xì)胞遷移和超氧陰離子產(chǎn)生的炎癥過(guò)程,具有良好的體外抗炎作用。
異綠原酸對(duì)細(xì)菌和真菌均具有一定的抑制效果。從結(jié)構(gòu)上來(lái)看,異綠原酸比綠原酸更對(duì)稱(chēng),極性更小,且包含兩個(gè)咖啡?;?,使其有更多羥基,因此可以推測(cè),異綠原酸比綠原酸破壞細(xì)菌細(xì)胞壁、膜結(jié)構(gòu)的能力更強(qiáng),抑菌效果更好。周志娥等[14]發(fā)現(xiàn)綠原酸和異綠原酸A 對(duì)大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)于苯甲酸鈉和山梨酸鉀。楊岸奇等[15]發(fā)現(xiàn)綠原酸對(duì)一些真菌也有抑制作用,如新生隱球菌、念珠菌和煙曲霉。當(dāng)綠原酸奎寧基團(tuán)上的羥基與游離氨基結(jié)合時(shí),對(duì)真菌的抑制作用更強(qiáng)。李更森[16]發(fā)現(xiàn),異綠原酸可以降低體外構(gòu)建的野生型銅綠假單胞菌-煙曲霉混合生物膜細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。異綠原酸與兩性霉素B+美羅培南聯(lián)合應(yīng)用,可明顯提高混合生物膜內(nèi)煙曲霉菌和銅綠假單胞菌的殺滅效果,即對(duì)真菌及細(xì)菌的殺滅均具有顯著的協(xié)同作用。羅勁等[17]發(fā)現(xiàn)異綠原酸在體外不能殺死煙曲霉生物被膜內(nèi)菌體,但可對(duì)煙曲霉早期和成熟期生物被膜有破壞作用,其作用呈濃度依賴(lài)性。張瑾鈺等[18]通過(guò)在體外復(fù)制煙曲霉的生物膜模型,證明了異綠原酸對(duì)體外煙曲霉生物膜形成有抑制作用,因此具有一定的抗真菌活性。
雖然許多文獻(xiàn)中均提到異綠原酸具有抗病毒活性,但通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明異綠原酸抗病毒作用的文獻(xiàn)依然較少。有研究表明,綠原酸類(lèi)物質(zhì)可以通過(guò)增強(qiáng)DNA自我保護(hù)來(lái)抑制HBV病毒感染,這對(duì)乙型肝炎病毒的體內(nèi)復(fù)制具有很好的阻礙作用。在此基礎(chǔ)上,楊岸奇等[15]的研究表明,起抗HBV病毒作用的綠原酸類(lèi)物質(zhì)主要是異綠原酸C和異綠原酸A。付運(yùn)星[19]建立了犬瘟熱病毒感染犬腎細(xì)胞(MDCK)模型,證明了異綠原酸A可以通過(guò)影響TLR3信號(hào)通路,在體外成功抵抗犬瘟熱病毒感染,但無(wú)法對(duì)犬瘟熱病毒進(jìn)行進(jìn)一步滅活以及無(wú)法預(yù)防犬瘟熱病毒對(duì)動(dòng)物機(jī)體的感染,即異綠原酸A可以作為潛在抗犬瘟熱病毒的物質(zhì)。Cao等[20]等通過(guò)建立細(xì)胞和動(dòng)物模型,證實(shí)食品中提取的抗氧化劑異綠原酸C可通過(guò)調(diào)節(jié)谷胱甘肽的氧化還原穩(wěn)態(tài),防止腸病毒71(ev71)感染,從而體現(xiàn)異綠原酸C 的抗病毒作用。另外,美國(guó)加州大學(xué)Robinson等[21]研究發(fā)現(xiàn),異綠原酸A不僅抑制能HIV-1整合酶的活性,還能阻礙HIV-1病毒在組織中的復(fù)制過(guò)程,其治療指數(shù)高于100。
由于異綠原酸與綠原酸在結(jié)構(gòu)上很相似,所以同樣具有良好的體內(nèi)外抗氧化活性。侯彩平[12]采用DPPH法、水楊酸比色法、鄰苯三酚自氧化法及還原力測(cè)定法來(lái)進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗(yàn),利用皮膚熒光斑馬魚(yú)模型研究異綠原酸的體內(nèi)抗氧化活性。結(jié)果表明,異綠原酸A對(duì)自由基有較好的清除能力,有良好的體內(nèi)體外抗氧化活性,并且發(fā)現(xiàn)隨著異綠原酸A濃度的增加,其相對(duì)抗氧化能力逐漸下降。楊岸奇等[15]建立了四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型,并對(duì)其原位及其t-BOOH介導(dǎo)的心臟和肝臟勻漿進(jìn)行化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn),證明綠原酸的幾種同分異構(gòu)體均具有一定的抗氧化作用。Iwai等[22]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明異綠原酸C是綠咖啡豆7種咖啡??鼘幩犷?lèi)化合物中抗氧化活性最好的。還有研究表明,3,5-二咖啡??鼘幩嵬ㄟ^(guò)激活pi3k/akt 信號(hào)通路保護(hù)h9c2心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡[23]。Xia等[24]將化學(xué)分析和生物活性鑒定相結(jié)合,用DPPH、ABTS等自由基清除實(shí)驗(yàn)得出艾蒿中的綠原酸、異綠原酸B、A、C、麥角酰二醇、乙酰西丁和尤帕替林等成分具有較強(qiáng)的抗氧化活性。Liu等[25]用DPPH自由基清除活性測(cè)定法評(píng)價(jià)50%金銀花甲醇提取物抗氧化活性。結(jié)果表明,該提取物的抗氧化活性與指紋圖譜中的異綠原酸B、異綠原酸C、異綠原酸A及木犀草苷四峰密切相關(guān)。
近年來(lái),國(guó)內(nèi)外的學(xué)者在異綠原酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)增強(qiáng)肝功能代謝及其保護(hù)作用方面研究較多。楊岸奇等[15]在其研究中發(fā)現(xiàn),異綠原酸類(lèi)物質(zhì)能修復(fù)由巨噬細(xì)胞和氯仿引起的肝損傷,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)囊吾提取物異綠原酸B可以緩解肝臟脂肪過(guò)氧化的過(guò)程,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)10 μg/mL 的異綠原酸B 溶液的250 μg/mL 囊吾提取物溶液與對(duì)于降低由乙酰氨基酚注射引起的肝臟脂肪代謝障礙具有相當(dāng)?shù)男Ч?。Hao等[26]發(fā)現(xiàn)異綠原酸具有抗乙型肝炎作用,主要體現(xiàn)在:異綠原酸A的抗氧化性能和誘導(dǎo)細(xì)胞中血紅素氧合酶-1 可以達(dá)到對(duì)肝的保護(hù)作用。發(fā)現(xiàn)異綠原酸B能抑制氧化應(yīng)激,通過(guò)特定的信號(hào)通路抑制多種成纖維因子,對(duì)非酒精性脂肪性肝炎纖維化有顯著的保護(hù)作用。
特別是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院劉鑫團(tuán)隊(duì),連續(xù)多次使用異綠原酸B 或C 對(duì)四氯化碳引起的小鼠肝損傷模型進(jìn)行研究,最終發(fā)現(xiàn)其相關(guān)信號(hào)通路,對(duì)肝炎纖維化的治療具有一定的臨床指導(dǎo)意義。2017年,劉鑫等[27]發(fā)現(xiàn)異綠原酸B(ICAB)對(duì)四氯化碳(CCl4)引起的小鼠急性肝損傷具有明顯地保肝降酶作用,其作用機(jī)制可能與參與調(diào)節(jié)其肝細(xì)胞中核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)信號(hào)通路、緩解氧化應(yīng)激相關(guān)。并且異綠原酸B在抗神經(jīng)退行性疾病方面優(yōu)于綠原酸也已被證實(shí),這可能是因?yàn)楫惥G原酸B有更多的酚羥基。2019年,Liu等[28]又通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí),分離自兔耳草的異綠原酸B能通過(guò)Nrf2 抑制氧化應(yīng)激和通過(guò)mir-122/hif-1 信號(hào)通路抑制多種促纖維化因子,對(duì)非酒精性脂肪性肝炎的纖維化有顯著的保護(hù)作用。2020 年,Liu 等[29]的研究再次表明從紫菀中分離得到的異綠原酸A 可能通過(guò)抑制hmgb1/tlr4/nf-kappa 信號(hào)通路,來(lái)抵抗CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。
異綠原酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)某些癌癥具有一定的治療或輔助治療的作用。Yu 等[30]研究了金銀花提取物異綠原酸C 抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞系(tnbc) mda-mb-231(egfr)水平升高的分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)了異綠原酸C(icac)對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(emt)和mda-mb-231 細(xì)胞侵襲的抑制作用依賴(lài)于egfr/磷脂酶c(plc)/extracellular regulated protein kinase 1(erk1)/slug信號(hào)通路的結(jié)論。此結(jié)論可以為下一步治療tnbc的策略提供線索。楊岸奇等[15]將其對(duì)綠原酸及其衍生物(包括異綠原酸)在加強(qiáng)抗癌藥物作用效果方面的研究開(kāi)發(fā)成了專(zhuān)利,并闡明了其機(jī)理是綠原酸及其衍生物可增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感程度,從而使抗癌藥物能更好地發(fā)揮療效。
Wang等[31]研究表明異綠原酸A對(duì)LPS誘導(dǎo)的nfb/nlrp3信號(hào)通路的蛋白質(zhì)表達(dá)有抑制作用,可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的作用,是治療急性肺損傷的有前途的單體,為今后急性肺損傷的治療研究提供參考。
異綠原酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)平滑肌抑制作用體現(xiàn)在能解除支氣管平滑肌痙攣和抑制消化道平滑肌收縮。楊岸奇等[15]分別利用電流和乙酰膽堿刺激豚鼠回腸,發(fā)現(xiàn)異綠原酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)抑制回腸平滑肌收縮有一定的抑制作用,且此作用與罌粟堿作用相似。
Zhang 等[32]研究表明,從艾蒿及其酯類(lèi)衍生物中分離得到的3,5-二咖啡??鼘幩峋哂锌顾{(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)的亮氨酸合成酶和潛在的抗賈第鞭毛蟲(chóng)作用。
張瓊光等[33]證明,苦丁茶中異綠原酸部位能顯著改善實(shí)驗(yàn)性2 型糖尿病小鼠的糖脂代謝紊亂。湯潔等[34]發(fā)現(xiàn)金銀花中的綠原酸、異綠原酸具有參與人體血小板凝集和凝血因子的生成等作用。Oh 等[35]研究表明596 μmol/L 的異綠原酸A 和534 μmol/L 的異綠原酸C具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性,這表明異綠原酸類(lèi)化合物可能具有降低血壓的作用。
文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn),異綠原酸類(lèi)化合物主要來(lái)源于金銀花、苦丁茶、甜葉菊、艾蒿、兔耳草、丁公藤等天然植物。近年來(lái),針對(duì)不同天然植物來(lái)源的異綠原酸,研究學(xué)者們分別開(kāi)發(fā)了如熱回流提取法、大孔樹(shù)脂吸附法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、酶解等提取方法。但相對(duì)于綠原酸來(lái)說(shuō),異綠原酸的提取工藝研究依然較少。
異綠原酸類(lèi)化合物極性較大,一般需要選用水、甲醇、乙醇等大極性的提取溶劑進(jìn)行提取。Scharlack等[36]發(fā)現(xiàn),使用醇溶劑浸取得到的綠原酸類(lèi)化合物具有較好的穩(wěn)定性,若同時(shí)采用超聲輔助浸取可提高該類(lèi)化合物的得率。倪付勇等[13]首先對(duì)金銀花用70%的乙醇進(jìn)行提取,提取液再用大孔樹(shù)脂吸附法進(jìn)行分離和富集,最后利用制備色譜制備出高含量的咖啡酰奎寧酸類(lèi)化合物,此舉可經(jīng)濟(jì)、快速、有效地得到異綠原酸A、B、C,為金銀花中異綠原酸類(lèi)化合物的分離開(kāi)辟了新思路。楊敏[11]設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)對(duì)苦丁茶中異綠原酸水提取工藝進(jìn)行條件優(yōu)化,并采用高效液相色譜測(cè)定各工藝參數(shù)下得到的異綠原酸總含量。最終優(yōu)化出的提取工藝能將總異綠原酸的含量提高到82.30%。汪愛(ài)國(guó)等[37]采用自制螺旋管分餾萃取裝置連續(xù)萃取分離了金銀花粗粉中的綠原酸和總分異綠原酸。以水為流動(dòng)相,乙酸乙酯為固定相,每個(gè)循環(huán)周期泵入原料液20 mL,流動(dòng)相50 mL,反推固定相40 mL在該條件下,綠原酸和總分異綠原酸分離完全,最終得到總分異綠原酸干燥產(chǎn)品,純度為82.3%,回收率為90%。由于該套設(shè)備結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便,連續(xù)制備量可達(dá)數(shù)千克每日,因此有利于工業(yè)化放大,可同時(shí)完成多級(jí)逆流萃取、分餾萃取和色譜洗脫等多種分離手段。
Sun等[38]采用高速逆流色譜(hsccc)和液-液萃取相結(jié)合的方法,成功地從中藥材中分離出異綠原酸A和異綠原酸B。以乙酸乙酯和-己烷-乙酸乙酯-水(3∶3∶4和1∶5∶4,V/V/V)為液-液萃取溶劑體系,去除混合物中的高、低極性雜質(zhì)。60 g的乙醇提取物經(jīng)溶劑分配精制得到1.7 g的富集部分,其中480 mg的異綠原酸A (純度98.3%)52.5 mg和37.6 mg的異綠原酸B(純度96.2%)。Qiu等[39]采用酶微反應(yīng)器與高效液相色譜相結(jié)合的方法,建立了一種在線篩選方法。并用該在線篩選系統(tǒng)從金銀花葉片中分離得到3個(gè)化合物,分別為異綠原酸B、1,5-二咖啡??鼘幩岷彤惥G原酸C。該方法對(duì)中草藥中葡萄糖苷酶抑制劑的快速實(shí)時(shí)捕獲具有很大的潛力。Jiang等[40]開(kāi)發(fā)了一種以離子液體為基礎(chǔ)的超聲波輔助提取技術(shù)(il-uae),該技術(shù)是一種可持續(xù)地從杭白菊中提取和分離異綠原酸C的新方法。
由于異綠原酸的含量檢測(cè)一般需要多種對(duì)照品,并且異綠原酸對(duì)照品價(jià)格比較昂貴,所以除了少量研究是開(kāi)發(fā)單個(gè)異綠原酸的檢測(cè)方法外,目前主流的檢測(cè)方法為王智民等[41]提出的一測(cè)多評(píng)的多指標(biāo)質(zhì)控模式。
甘玉等[42]以乙腈-0.1%磷酸(20∶80)為流動(dòng)相,采用高效液相色譜儀和紫外檢測(cè)器對(duì)金銀花中異綠原酸A的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,在9.6~96 μg/mL范圍內(nèi),異綠原酸A 濃度和峰面積的線性關(guān)系良好,異綠 原 酸A 的 平 均 回 收 率 為102.07%(n=6),RSD 為1.02%。該方法符合方法學(xué)考察的規(guī)定,可作為金銀花醇提液中異綠原酸A單個(gè)含量測(cè)定的方法。
付曉等[43]建立了同時(shí)測(cè)定甜葉菊中綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸C三種化合物的HPLC分析方法,并完成了此3 種化合物在根、莖、葉中的含量測(cè)定。結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度高,重復(fù)性好,可用于同時(shí)檢測(cè)甜葉菊中3種異綠原酸類(lèi)化合物。陳嘉媛等[44]建立了驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊中異綠原酸A 和異綠原酸C 含量的同時(shí)檢測(cè)方法,該方法采用Shim-pack VP-ODS C18 柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以甲醇-乙腈-0.4%磷酸溶液(13.5∶13.5∶73)為流動(dòng)相,流速為1 mL/min,柱溫35 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm,進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果證明該方法可用于同時(shí)檢測(cè)驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊中異綠原酸A 和異綠原酸C的含量,并可為鑒定驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊的藥材質(zhì)量提供幫助。張民達(dá)等[45]建立了一種同時(shí)測(cè)定甜葉菊原料中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等6種綠原酸類(lèi)化合物的HPLC分析方法。此一測(cè)多評(píng)法以綠原酸為內(nèi)標(biāo),采用斜率校正法建立其與甜葉菊中其他5 種綠原酸類(lèi)化合物及槲皮苷在相同條件下的相對(duì)校正因子,以此求得這幾種物質(zhì)的含量,并同時(shí)采用外標(biāo)法進(jìn)行同步驗(yàn)證。結(jié)果表明此一測(cè)多評(píng)法準(zhǔn)確性高,與外標(biāo)法所得結(jié)果無(wú)顯著差異,可用于甜葉菊原料藥材的質(zhì)量控制。印酬等[46]建立了測(cè)定山銀花中新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C含量的HPLC分析方法,并用其觀察了貴州不同產(chǎn)地的10 批山銀花中的4 種異綠原酸的含量。徐小昆等[47]采用高效液相色譜方法對(duì)丁公藤屬植物中東莨菪苷、東莨菪素、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C等6種有效成分含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定,結(jié)果表明該一測(cè)多評(píng)法分離效果較好,簡(jiǎn)便可行,適用于丁公藤類(lèi)藥材的質(zhì)量控制。
除此之外,特征圖譜已經(jīng)在中藥材及其提取物方面有了廣泛的應(yīng)用,也可作為中藥材及其提取物在溯源上的質(zhì)量檢驗(yàn)指標(biāo)。因此,異綠原酸在質(zhì)量控制方面亦可采用特征圖譜,從源頭控制其產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)、安全、無(wú)公害,并保障其產(chǎn)品的可控性、規(guī)范化。