陳悅，唐競桐，羅仕蓉

遵義醫(yī)藥高等?？茖W校，貴州 遵義 563006

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)指以肺動脈壓力和肺血管阻力增高等血流動力學紊亂為主要臨床特征的一系列臨床癥候群，目前已成為一個國際性的醫(yī)療保健難題[1]。PAH疾病進展的關(guān)鍵病理特征為肺血管重塑。肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)作為調(diào)控血管舒縮功能的關(guān)鍵，在PAH 的重塑過程中被激活，誘發(fā)PASMCs 的異常惡性增殖并刺激細胞的持續(xù)收縮，導致肺動脈血管壁增厚和管腔狹窄，最終引發(fā)肺血管壓力和阻力升高及右室負荷增加[2-3]。因此，如何靶向調(diào)控PASMCs 的惡性增殖能力抑制肺血管重塑是PAH當前的重要研究前沿[4]。

6-甲基腺苷(N6-methyladine，m6A)作為中心法則中RNA轉(zhuǎn)錄后修飾的重要環(huán)節(jié)，是指在RNA腺嘌呤上第6 號位氮原子上加入或去除甲基團修飾的過程[5]。新近研究表明RNA 的轉(zhuǎn)錄后表觀調(diào)控方式可調(diào)控RNA 的轉(zhuǎn)錄后代謝全過程，包括對RNA 的轉(zhuǎn)錄后剪切出核[6]、穩(wěn)定性[7]、降解及翻譯[8]等。m6A受到多種促甲基化、去甲基化以及甲基化識別蛋白的動態(tài)調(diào)控。其中，甲基轉(zhuǎn)移樣酶3 (methyltransferase like 3，METTL3)作為促進m6A修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶復合物核心，可促進RNA 的m6A 修飾介導RNA 的轉(zhuǎn)錄后代謝，參與多種疾病的病理過程。

METTL3 在多種腫瘤組織中可引發(fā)異常m6A 修飾促進包括胃癌細胞[9]、結(jié)直腸癌細胞[10]在內(nèi)的多種腫瘤細胞增殖效應。然而，METTL3介導的RNA甲基化修飾m6A 是否對于PAH 中PASMCs 的異常增殖功能是否具有調(diào)控作用尚不清楚。鑒于PAH 進展過程中PASMCs呈“腫瘤樣”細胞增殖改變促進肺血管重塑過程。本研究擬探索參與m6A 修飾的關(guān)鍵促甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3 是否參與PASMCs 的增殖調(diào)控功能，明確METTL3 依賴的m6A 修飾是否參與PASMCs 的增殖調(diào)控中，為靶向RNA 表觀轉(zhuǎn)錄后修飾機制在PAH治療中提供潛在的干預方式。

1 材料與方法

1.1 主要材料 6～8 周齡SD 大鼠共20 只(購置于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司)、DMEM 培養(yǎng)液(Gibco，11995115)、FBS (MRC，CCS30009.02)、DTT(Roche，10197777001)、Ⅰ型膠原酶(Sigma，1148089)、兔抗α-SMA(Abcam，ab5649)、兔抗METTL3(Abcam，ab195352)、m6A比色法檢測試劑盒(Epigentek，P-9005)、siNC/siMETTL3 (Ribobio，siG180122034132)、RNAi Max (Thermo，13778)、CCK-8 (凱基生物，KGA317)、EdU細胞增殖檢測試劑盒(Ribobio，C10310)。

1.2 大鼠PASMCs 的培養(yǎng)及鑒定 取6～8 周齡SD 大鼠共20 只(每次原代培養(yǎng)需6～8 只)，頸椎脫臼處死后采用75%酒精浸泡消毒，置入超凈工作臺中分離獲取肺動脈主干和左右肺動脈干，去除外膜結(jié)締組織內(nèi)膜后眼科剪反復剪碎為1 mm3。置入適量含0.14 mg/mL DTT、2 mg/mL BSA、8.53 mg/mL Ⅰ型膠原酶及0.2 mg/mL D-Hank's配制的消化液中吹打均勻，37℃水浴鍋中消化約90 min，每20～30 min觀察一次，待消化完全后，離心收集細胞加入適量含10%FBS+1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。擴增至70%左右時傳代，利用差速貼壁純化細胞，將終止消化后的細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)30 min，緩慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，將細胞懸液吸出加入到另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，重復上述操作2次。最后按1∶3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，隔天換一次完全培養(yǎng)液。取3～5 代細胞進行爬片，采用細胞免疫熒光技術(shù)檢 測α-平 滑 肌 肌 動 蛋 白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達以鑒定PASMCs的細胞純度。

1.3 細胞siRNA 轉(zhuǎn)染 將PASMCs 分為siNC 組與siMETTL三組，按照siRNA轉(zhuǎn)染試劑說明書分別配置10 μmol/L siNC及siMETTL3儲存液，根據(jù)25 cm2培養(yǎng)瓶大小，轉(zhuǎn)染試劑混合物配置為：2.5 μL siRNA儲存液+7.5 μ L siRNA 轉(zhuǎn) 染 試 劑(RNAi Max)+250 μ L DMEC 培養(yǎng)液。配置完成后加入適量不含雙抗的完全培養(yǎng)液中混勻待用。對融合70%左右的PASMCs進行換液，PBS潤洗一遍，加入上述配置好的含siRNA轉(zhuǎn)染混合物的DMEM 完全培養(yǎng)液，置入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用RT-qPCR 及Western blot 檢測METTL3的表達，驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.4 m6A比色法測定 采用m6A比色法試劑盒檢測下調(diào)METTL3 后PASMCs 總體m6A 修飾水平。細胞處理完成后，采用Trizol 法分別提取siNC 組及siMETTL3 組總RNA。將提取出的總RNA 定量后用RNase-free水或TE Buffer溶液稀釋至1～8 μL的樣品中，確保每個酶標孔內(nèi)加入的RNA含量為200 ng。根據(jù)試劑盒使用說明，用1×Wash Buffer作為母液分別按需配置

Capture Antibody、Detection Antibody、Enhancer Solution、m6A的陽性對照以及Stop Solution等。提取并定量后的RNA，經(jīng)過m6A RNA的結(jié)合、捕捉及清洗等步驟、最終在酶標儀上450 nm 處檢測吸光度的變化，并根據(jù)OD450吸光度值分別計算出兩組PASMCs m6A的相對表達量。

1.5 PASMCs 細胞增殖檢測 采用CCK-8 法檢測細胞增殖功能。取3～5 代PASMCs，1%FBS 誘導細胞同步化后，接種于96孔板中，設(shè)置空白對照孔(不加細胞)、siNC孔以及siMETTL3孔，每孔加入5 000細胞數(shù)的細胞懸液200 μL，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。采用上述方法分別轉(zhuǎn)染siNC 及siMETTL3 后加入含20%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，誘導結(jié)束后每孔加入10 μL CCK-8溶液37℃下繼續(xù)孵育1 h，采用酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度；采用EdU檢測細胞增殖改變，根據(jù)上述分組將細胞接種于96孔中，按照EdU試劑盒說明分別加入EdU標記孵育2 h，4%多聚甲醛固定，甘氨酸脫色后加入適量0.5%Triton通透10 min，PBS洗滌后加入Apollo染色反應液染色，最后加入Hoechst染核后置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，兩組間差異比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PASMCs 細胞鑒定 鏡下見細胞為梭形或長梭形，核居中，呈橢圓形或圓形，通過細胞免疫熒光檢測，見鏡下幾乎絕大多數(shù)細胞表達PASMCs 特異性標志物α-SMA(圖1)。表明通過酶消化法可獲取純度較高的PASMCs用于后續(xù)進一步實驗。

2.2 siRNA 抑制METTL3 表達可下調(diào)PASMCs的m6A總體修飾水平 RT-qPCR結(jié)果顯示(圖2 A)，與

siNC 組比較，siMETTL3 組METTL3 mRNA 表達量顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Western Blot結(jié)果顯示(圖2B、2C)，與siNC組比較，siMETTL3組目的基因METTL1的蛋白表達水平發(fā)生顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。m6A比色法檢測結(jié)果顯示(圖2D)，與siNC 組比較，siMETTL3 組m6A 修飾發(fā)生顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 下調(diào)METTL3 可抑制20% FBS 誘導的PASMCs細胞增殖 CCK-8檢測結(jié)果顯示(圖3 A)，與siNC 組比較，siMETTL3 組OD 值顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。EdU 檢測結(jié)果顯示，與siNC 組相比(圖3B～3C)，siMETTL3組EdU陽性細胞數(shù)顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 PASMCs免疫熒光鑒定

圖2 siMETTL3效率驗證及對m6A修飾的影響

圖3 siMETTL3對PASMCs細胞增殖的影響

3 討論

PAH 已成為當前心臟及呼吸系統(tǒng)疾病領(lǐng)域的重要防治難題，盡管其臨床分類多樣，但不同類型的PAH 間具有相似的病理生理基礎(chǔ)。在PAH 肺血管重塑過程中，PASMCs促增殖與抑制因素的調(diào)節(jié)平衡失調(diào)，導致PASMCs 發(fā)生異常惡性增殖。如何靶向調(diào)控PASMCs 的增殖失衡是當前PAH 防治的重要環(huán)節(jié)。PAH與表觀遺傳的關(guān)系密切，既往通過靶向表觀遺傳機制應對PAH 的防治研究取得重要進展[11-12]。例如DNA 層面的甲基化調(diào)控[13]、RNA 層面的非編碼RNA干預[14-15]以及蛋白層面的翻譯后修飾[16]等。

然而，關(guān)于RNA 轉(zhuǎn)錄后層面的表觀遺傳學修飾m6A 與PAH 的關(guān)聯(lián)及作用目前尚無報道。本實驗創(chuàng)新性的探討了表觀遺傳學中重要的轉(zhuǎn)錄后修飾類型m6A 否參與了PAH 肺血管重構(gòu)過程中PASMCs 的異常惡性增殖過程。以m6A 修飾的關(guān)鍵甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3 為切入點，探索了METTL3 在調(diào)控PASMCs的細胞增殖中的作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用小干擾RNA下調(diào)METTL1的表達可顯著抑制PASMCs的整體m6A修飾水平，并進一步導致PASMCs的細胞活性及EdU陽性細胞比例降低。這些結(jié)果說明，敲低METTL3的表達可抑制20%FBS誘導的PASMCs增殖功能。研究表明，METTL3介導的m6A甲基化修飾效應在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要且復雜的角色[17]。METTL3不僅可促進胰腺癌細胞[18]和膀胱癌細胞[19]增殖及侵襲功能，還可促進子宮內(nèi)膜癌的增殖及致瘤性[20]。說明METTL3 在促進多種細胞的增殖調(diào)控中具有重要作用。我們的研究表明，敲低METTL3 的表達后，m6A 發(fā)生顯著下調(diào)的同時抑制了PASMCs 的細胞增殖功能。進一步夯實了METTL3 介導的m6A 甲基化在表觀轉(zhuǎn)錄后修飾中的作用。

本研究通過創(chuàng)新性探討中心法則中RNA 層面的甲基化修飾m6A 對PASMCs 的增殖異常參與肺血管重構(gòu)過程。基于METTL1 的PASMCs 靶向抑制或可為PAH的治療提供潛在的干預靶點。盡管如此，本研究尚有不足之處。METTL3 依賴的m6A 修飾如何影響PASMCs 下游關(guān)鍵的促增殖信號分子的RNA 代謝過程機制尚不清楚，有待后續(xù)深入研究。