王友元，石麗穎，孫凱鑫，李前慶，呂文發(fā)*，王 軍*

（1.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118；2.動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118）

在奶牛生產(chǎn)過程中，子宮內(nèi)膜炎是最為常見的繁殖障礙性疾病，該病可降低奶牛的繁殖性能甚至造成不孕，不僅減少產(chǎn)奶量還增加飼料消耗，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。革蘭氏陰性細(xì)菌通常認(rèn)為是損害子宮內(nèi)膜的病原體[1-2]，脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的組成部分，是免疫系統(tǒng)中最有效的刺激物之一[3]，已廣泛用于急性肺損傷、乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎等炎癥模型的建立[4-5]。據(jù)報(bào)道，LPS 可以誘導(dǎo)Toll 樣受體4（TLR4）信號(hào)通路活化，繼而導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子過量表達(dá)[6]，當(dāng)LPS 刺激TLR4 表達(dá)時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)NF-κB 途徑激活[7-8]，促進(jìn)白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥細(xì)胞因子的分泌，從而加劇炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷[9-10]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是綠茶中的主要活性成分[11]，是眾多綠茶提取物中對(duì)抗細(xì)菌、病毒和真菌的最有效物質(zhì)[12]，并且具有強(qiáng)大的抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用[13-14]。試驗(yàn)研究和臨床研究表明，EGCG 可以有效抑制大鼠乳腺炎及小鼠急性肺損傷的發(fā)生[15-16]，但在子宮內(nèi)膜炎上的研究還未見報(bào)道。本研究旨在探討EGCG 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠子宮內(nèi)膜炎的治療作用及其機(jī)制，為EGCG 預(yù)防和治療LPS 誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜炎的研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 EGCG（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司），LPS（Sigma，美國(guó)）；抗體均為CST (美國(guó))產(chǎn)品；小白鼠購(gòu)自沈陽(yáng)長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取60 只10 周齡體重為30～35 g、健康狀況良好的雌性昆明小白鼠，按體重隨機(jī)分為5 組，每組12 只，適應(yīng)7 d 后將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS 組、EGCG（1、5、10 mg/kg）+LPS 組。將LPS 和EGCG 溶于無(wú)菌生理鹽水中至所需濃度。麻醉小鼠后用留置針軟管向小鼠子宮內(nèi)注入20 μL LPS（2.5 mg/mL）以建立子宮內(nèi)膜炎模型[17]，灌注LPS 6 h 后，EGCG+LPS 組小鼠腹腔內(nèi)分別注射不同濃度的EGCG（1、5、10 mg/kg）3 次，每6 h 注射1 次，對(duì)照組和LPS 組以相同方式注射生理鹽水。24 h 后全部小鼠進(jìn)行安樂死，并收集子宮組織凍存于-80℃，用于后續(xù)檢測(cè)試驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR 分析 采用RNAiso Plus（TaKaRa，日本）提取小鼠子宮組織的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于qRT-PCR 試驗(yàn)。本試驗(yàn)所需的基因引物序列見表1。引物由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)及合成。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性120 s；95℃變性15 s，60℃退火30 s，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)。運(yùn)用 2－△△Ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。引物退火溫度均為60℃。

1.4 ELISA 檢測(cè) 嚴(yán)格按照試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）說明書進(jìn)行操作，利用連續(xù)光譜酶標(biāo)儀（Biotek，美國(guó)）檢測(cè)所有小鼠子宮組織裂解液中的髓過氧化物酶（MPO）、IL-6、IL-1β和TNF-α含量。

1.5 Western blot 檢測(cè) 根據(jù)蛋白大小分別配制12% 的聚丙烯酰胺凝膠，采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）測(cè)定蛋白濃度，上樣20 μg/ 孔。80 V 電壓電泳至分離膠變?yōu)?60 V 電壓至電泳結(jié)束。采用半干法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為0.12 A 28 min，將目的蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜（NC）上。采用封閉液封閉1.5 h，一抗（1:1000）p-p65、p65、p-IκBα和IκBα（3033S、8242S、2859S 和4812S），4℃孵育過夜，TBST 洗5 次，每次5 min。孵育二抗（1:10000），室溫1 h，TBST 洗5 次，每次5 min。最后用ECL 發(fā)光液顯影，用TanonGis 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，比較組間差異性，數(shù)據(jù)用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用GraphPad Prism 8.0 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 子宮組織解剖學(xué)觀察 如圖1 所示，對(duì)照組小鼠具有健康的組織學(xué)形態(tài)，無(wú)病理學(xué)變化；在LPS 組中，子宮表現(xiàn)出明顯的病理?yè)p傷，伴有嚴(yán)重的充血和腫脹現(xiàn)象；經(jīng)EGCG 治療后，充血和腫脹明顯減少，子宮狀態(tài)得到顯著改善。

表1 基因引物合成信息

圖1 EGCG 治療效果驗(yàn)證

2.2 EGCG 對(duì)TLR4和MPO 活性的影響 如圖2 所示，LPS 組中TLR4 和MPO 活性較對(duì)照組極顯著增加，當(dāng)EGCG 注射量達(dá)到5 mg/kg 時(shí)TLR4極顯著下降，MPO顯著下降，當(dāng)EGCG 注射量達(dá)到10 mg/kg 時(shí)，兩者均極顯著下降。試驗(yàn)結(jié)果說明EGCG 緩解LPS 對(duì)子宮內(nèi)膜的侵害具有劑量依賴性。

圖2 EGCG 對(duì)TLR4 和MPO 表達(dá)的影響

2.3 EGCG 對(duì)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響 如圖3 所示，qRT-PCR 檢測(cè)表明，LPS 組 的IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA 水平較對(duì)照組極顯著上升，在EGCG 治療組中極顯著降低。ELISA 檢測(cè)顯示相同趨勢(shì)，當(dāng)EGCG 注射量達(dá)為1 mg/kg 時(shí)，IL-6、IL-1β和TNF-α顯著下降；當(dāng)EGCG 注射量為5 和10 mg/kg 時(shí)，IL-6、IL-1β和TNF-α極顯著下降。結(jié)果表明EGCG 抑制了LPS 誘導(dǎo)的子宮組織中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)及分泌。

2.4 EGCG 抑制LPS 誘導(dǎo)的NF-κB 途徑活化 由圖4可知，使用Western blot 分析表明，LPS 極顯著誘導(dǎo)了p65 和IκBα蛋白的磷酸化；10 mg/kg EGCG 顯著降低了p65 的磷酸化，極顯著降低了IκBα的磷酸化。試驗(yàn)結(jié)果表明，EGCG 可通過抑制TLR4 介導(dǎo)的NF-κB 活化減輕炎癥反應(yīng)。

3 討 論

子宮內(nèi)膜炎是子宮的一種炎癥狀態(tài)，大腸桿菌是最常見的病原體之一[1]。LPS 由大腸桿菌分泌，是一種有效的致炎物質(zhì)[18-19]，能夠作用于TLR4 從而激活NF-κB信號(hào)通路，隨后促進(jìn)IL-6、IL-1β和TNF-α等炎癥細(xì)胞因子的分泌來(lái)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞的募集，從而加重子宮內(nèi)膜上皮的損傷。本研究用LPS 誘導(dǎo)小鼠子宮內(nèi)膜炎模型，隨后腹腔注射EGCG 進(jìn)行治療試驗(yàn)，結(jié)果表明EGCG 可抑制TLR4介導(dǎo)的NF-κB 激活，從而減弱子宮內(nèi)膜炎發(fā)生過程中炎癥細(xì)胞因子的釋放。

圖3 EGCG 對(duì)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響

圖4 EGCG 抑制LPS 誘導(dǎo)的NF-κB 途徑活化

EGCG 對(duì)炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用[16]。本研究的解剖學(xué)觀察也表明，LPS 可導(dǎo)致子宮組織炎癥的發(fā)生，而EGCG 可顯著改善子宮的病理變化。MPO 活性與嗜中性粒細(xì)胞呈正相關(guān)關(guān)系，可以間接反映炎癥的嚴(yán)重性[20]，MPO 活性減弱意味著抗炎反應(yīng)降低，這表明EGCG 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜炎具有緩解作用。TLR4 是TLR（Toll 樣受體）家族之一，是LPS 的受體[21]。研究表明，LPS 可通過TLR4 誘導(dǎo)免疫反應(yīng)并介導(dǎo)NF-κB 途徑的活化[22]。NF-κB 是一種廣泛表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子，是炎癥最重要的調(diào)節(jié)劑之一[23]，當(dāng)IκBα發(fā)生磷酸化時(shí)，NF-κB 將被激活，然后遷移至細(xì)胞核內(nèi)，加劇炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[24-25]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，EGCG 可劑量依賴性地抑制TLR4的mRNA 表達(dá)，并抑制p-IκBα和p-p65 的蛋白水平，這表明EGCG 在治療LPS 誘導(dǎo)的小鼠子宮內(nèi)膜炎中是通過NF-κB 途徑實(shí)現(xiàn)的。IL-6 由細(xì)胞產(chǎn)生以應(yīng)對(duì)侵襲和傷害，這對(duì)白細(xì)胞募集和組織動(dòng)態(tài)平衡起著重要作用[26]。IL-1β是炎癥的主要介質(zhì)，主要由活化的巨噬細(xì)胞分泌[27]。TNF-α是一種多向性的促炎癥細(xì)胞因子，由多種細(xì)胞分泌，具有多種生物學(xué)功能[28]。有研究報(bào)道，LPS 誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜炎可以促進(jìn)IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)[29]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，EGCG 可顯著地減少這些炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌，從而減少LPS 對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜的侵害。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，EGCG 可下調(diào)TLR4 和MPO 的表達(dá)，抑制炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌，阻止NF-κB 信號(hào)通路的激活，提示EGCG 可作為預(yù)防和治療LPS 誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜炎的潛在藥物。