王家麒，韓福慧，趙 樂，賀建寧，周李生，李蘭蘭，柳 楠

（青島農業(yè)大學動物科技學院，山東青島 266109）

羊肉因其蛋白含量高、營養(yǎng)價值豐富越來越受到消費者歡迎，羊肉的口感和風味受肌內脂肪（Intramuscular Fat，IMF）含量影響[1]。動物的肌內脂肪細胞是由間充質干細胞定向分化形成前體脂肪細胞，進而在某些基因及通路的調控下分化為脂肪細胞[2-3]。miRNA 作為重要的轉錄后調控因子，已經被證明參與脂肪代謝和細胞分化等進程[4]。如miR-143 可以促進牛成纖維樣脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞[5]，miR-27a 調控RXRα基因抑制綿羊前體脂肪細胞的分化[6]。然而，關于miRNA 在調控綿羊肌內脂肪中的作用研究仍然較少，探索miRNA在綿羊肌內前體脂肪分化中的調控作用將對改善肉品質具有重大意義。

目前，關于miR-18b 的研究多集中于人類疾病。Murakami 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-18b 通過靶向TNRC6B基因來抑制肝細胞癌分化。Naml?s 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，從成骨細胞到骨肉瘤，再到骨骼，miR-18b 的表達量與細胞分化程度呈反比，這表明miR-18b 可能是細胞分化的關鍵因素。Sun 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-18b-3p 可以通過靶向ACOT13充當肌內脂肪細胞分化的抑制劑，但是miRNA-18b-3p 是否對綿羊肌內脂肪的形成產生調控作用沒有研究。硬脂酰輔酶A 去飽和酶（SCD）是催化單不飽和脂肪酸形成的限速酶，通過影響脂肪酸的比例調控脂質代謝，在家畜的乳脂品質及脂肪沉積中研究廣泛[10]。

本研究通過生信軟件預測到miRNA-18b-3p 與SCD 存在潛在結合位點，以分離獲得的敖漢細毛羊肌內前體脂肪細胞為實驗對象，對miR-18b-3p 在細胞分化過程中的作用進行研究，從分子水平上為綿羊選擇肉品質性狀提供參考，為加快肉毛兼用型細毛羊的選育給予分子育種技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取1 只3 日齡的健康敖漢細毛羊羔羊用于細胞培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 II 型膠原酶、TRIzol、無RNA 酶ddH2O等（青島賽尚試劑有限公司）；PBS（Cytiva 公司）；胎牛血清（FBS，Gibco 公司）；牛胰島素（INS）、油紅O 染液等（北京索萊寶有限公司）；異丁基-甲基-黃嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）等（Sigma 公司）；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒等（青島艾科瑞生物有限公司）；miR-18b-3p 反轉錄試劑盒（TaKaRa 公司）；蛋白裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、5×上樣緩沖液、蛋白 Marker 等（南京諾唯贊生物股份有限公司）；抗體（Proteintech 公司）；載體、轉染試劑GP-transfect-Mate（上海吉瑪生物有限公司）；雙熒光素酶載體psi-CHECK2、Dual-Luciferase system 試劑盒（Promega 公司）。

1.3 綿羊前體脂肪細胞分離培養(yǎng) 用無菌的剪刀、鑷子取3 日齡羔羊背最長肌，用含有雙抗（青霉素和鏈霉素）的無菌PBS 溶液沖洗數(shù)遍，在超凈臺內除去明顯可見的血管以及結締組織，將肌肉充分剪碎放入離心管中，加入II 型膠原酶，緩慢吹打，37℃震蕩充分消化成絮狀約1.5 h，加入等體積完全培養(yǎng)基終止消化后，用200目過濾篩過濾，離心后重懸細胞，置于恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d 更換1 次培養(yǎng)液。

1.4 綿羊前體脂肪細胞的誘導分化 將原代分離的細胞進行傳代，當細胞密度接近80%時，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，觀察細胞狀態(tài)為明顯接觸抑制時，換為誘導培養(yǎng)基（組成為DΜEΜ+0.5 mmol/L IBΜX+1 μmol/L 地塞米松+10 μg/mL胰島素+10% FBS+1%雙抗），此時記為0 d，培養(yǎng)2 d；換用維持培養(yǎng)基（DΜEΜ+10 μg/mL 胰島素+10% FBS+1%雙抗）分化2 d；然后用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細胞基本分化為脂滴。從0 d 開始每2 d 收集一次細胞。

1.5 油紅O 染色 使用含雙抗的PBS 清洗細胞后，加入細胞固定液；加入60% 異丙醇浸洗；在避光環(huán)境下將染色液A 與染色液B 按照3:2 的比例配制后，覆蓋細胞充分染色，水洗直到無多余染液；加入蒸餾水觀察脂滴染色情況。

1.6 miR-18b-3p 的靶基因預測 應用生信軟件TargetScan在線預測miR-18b-3p 的靶基因。

1.7 實時熒光定量PCR 分化0、2、4、6、8 d 時，采用Trizol 提取細胞總RNA，通過NanoDrop ND-2000儀器（Thermo Fisher Scientific）測定RNA 的純度和濃度。SCD、PPARγ、CEBPα基因反轉錄按照反轉錄試劑盒說明書進行，RNA 總量為1 μg，定量程序設置：95℃ 3 min；40 個循環(huán)：95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃20 s；72℃ 10 min 收集信號。以GAPDH為內參基因；miR-18b-3p 按照Mir-X miRNA 第一鏈合成試劑盒進行。以U6 作為miR-18b-3p 的內參基因。miRNA 定量程序設置：95℃ 10 min；45 個循環(huán)：95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s；72℃ 6 min 收集信號。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 細胞轉染 細胞消化后進行計數(shù)，將細胞轉移至六孔細胞培養(yǎng)板，每孔細胞密度統(tǒng)一調整為2×105個，轉染前細胞密度為70% 左右。轉染分為3 組，分別為過表達（miR-18b-3p mimics）組、抑 制（miR-18b-3p inhibitor）組、陰性對照組（miR-18b-3p NC），將DMEM 與轉染試劑輕輕混勻（A 液），將DMEM 與各組載體輕輕混勻（B 液），將A 液輕輕加入B 液中，室溫靜置15 min，此時將細胞用無雙抗PBS 清洗2 遍，完全清除血清后，每孔加入預熱的無雙抗培養(yǎng)基；向細胞中加入AB 混合液，放入培養(yǎng)箱約6 h 后在熒光顯微鏡下觀察轉染情況，并更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.9 miR-18b-3p 對基因mRNA 水平的影響 將轉染后的細胞按照1.3 中方法進行誘導分化，取分化2 d 的細胞，進行總RNA 的提取、反轉錄以及熒光定量PCR，步驟同1.6。

1.10 miR-18b-3p 對SCD 蛋白表達量的影響 取轉染后分化2 d 的細胞，提取蛋白。將細胞用PBS 清洗后與蛋白裂解液混勻，靜置5 min 后用細胞刮輕輕刮取細胞，移入1.5 mL 離心管中，埋于冰內裂解；12 000 r/min 離心5 min，取上清至離心管中，此時獲取的為總蛋白，通過蛋白定量試劑盒進行蛋白質濃度測定，加入 5×上樣緩沖液平衡蛋白濃度，煮沸后置于-20℃?zhèn)溆茫灰来闻渲?0%分離膠、5%濃縮膠，凝固后將Marker 和所需樣品緩慢加入泳道；200 V 穩(wěn)壓，凝膠電泳1～2 h 后300 mA 冰浴70 min 轉PVDF 膜；用牛奶進行封閉，2 h，40～50 r/min；室溫孵育一抗（1:2 000），2 h，40～50 r/min；用1×TBST在搖床清洗PVDF 膜，在避光環(huán)境下對二抗進行孵育1 h（1:1 000）；PVDF 膜搖床清洗多次，加顯色液（A 液:B液=1:1），凝膠成像儀上進行曝光。

1.11 雙熒光素酶驗證靶向關系 首先將SCD基因mRNA 野生型（SCD-3’UTR-wt）和突變型（SCD-3’UTR-mut）擴增至雙熒光素酶載體psi-CHECK2 中，并進行測序驗證；將構建好的目的質粒與miR-18b-3p模擬物（mimics）或陰性對照（mimics NC）共轉染到293T 細胞中，轉染共分4 個組：miR-18b-3p mimics 與SCD-3’UTR-wt 共轉染，mimics NC 與SCD-3’UTRwt 共轉染，miR-18b-3p mimics 與SCD-3’UTR-mut共轉染，mimics NC 與SCD-3’UTR-mut 共轉染；在轉染約6 h 后給細胞換液，轉染48 h 后對細胞信號進行檢測。

1.12 統(tǒng)計分析 本研究中結果均以平均值± 標準差表示。統(tǒng)計分析使用SPSS 20.0 軟件進行，測定的數(shù)據采用獨立樣本t檢驗進行分析。P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結果

2.1 前體脂肪細胞的分化形態(tài) 原代細胞培養(yǎng)4 d，可見細胞數(shù)量較多，生長狀態(tài)良好（圖1-A）；為分化至4 d 時的狀態(tài)，可見細胞出現(xiàn)典型的脂環(huán)狀結構（圖1-B）；分化至6 d 時，視野下脂滴大量聚集（圖1-C）；分化至8 d 時，細胞數(shù)量明顯減少，細胞已經分化為大量脂滴，培養(yǎng)基表面呈油狀，對細胞進行油紅O 染色，大面積脂滴被染為紅色（圖1-D），說明前體脂肪細胞分化成功。

圖1 綿羊前體脂肪細胞的培養(yǎng)及分化驗證

2.2 miR-18b-3p 的靶基因預測 使用TargetScan 對miR-18b-3p 的靶基因進行預測，如圖2 所示，miR-18b-3p與SCD存在結合位點，說明miR-18b-3p 可能與SCD的3'UTR 相結合，SCD基因是miR-18b-3p 的潛在靶基因。

圖2 miR-18b-3p 與SCD 基因的靶向結合位點

2.3 基因在綿羊前體脂肪細胞分化時期的時序性表達如圖3 所示，miR-18b-3p 的表達先上升后下降，2 d 表達量高于0 d（P<0.01），6 d 時表達量達到最高（P<0.01），8 d 時表達量下降；SCD基因的表達量與miR-18b-3p相似，但是2 d 與0 d 表達量差異不顯著，8 d 時表達量下降不顯著，但仍高于0、2、4 d 的表達量（P<0.01）。由圖4 可知，分化標志基因PPARγ在分化過程中始終高表達，在4 d 時表達量高于其他時期（P<0.01），6 d 與8 d 的表達量差異不顯著；C/EBPα的表達趨勢與SCD基因相似，在4、6、8 d 時表達量始終高于0 d 和2 d的表達量（P<0.01）。

2.4 過表達miR-18b-3p 對前體脂肪細胞分化的作用如圖5 所示，轉染miR-18b-3p 過表達載體（mimics）后，miR-18b-3p 的表達量高于陰性對照組（P<0.01）；SCD基因在mRNA 及蛋白水平低于陰性對照組（P<0.01）。由 圖6 可 知，過表達miR-18b-3p 后，PPARγ及C/EBPα基因表達量低于陰性對照組（P<0.05）。綜上，miR-18b-3p 過表達載體轉染成功且顯著抑制了SCD與PPARγ及C/EBPα基因的表達，從而抑制了細胞分化。

圖3 綿羊前體脂肪細胞分化過程中miR-18b-3p、SCD 基因的時序性表達

圖4 綿羊前體脂肪細胞分化過程中標志基因PPARγ、C/EBPα 時序性表達

圖5 轉染過表達載體后miR-18b-3p 與SCD 基因的表達量

圖6 轉染過表達載體后標志基因mRNA 的相對表達量

2.5 抑制miR-18b-3p 對前體脂肪細胞分化的作用 如圖7 所示，miR-18b-3p 抑制載體（inhibitor）轉染細胞后，miR-18b-3p 表達量低于陰性對照組（P<0.01），而SCD基因mRNA 及蛋白表達量高于陰性對照組（P<0.01）。由圖8 可知，相較于陰性對照組，抑制miR-18b-3p 的表達后，PPARγ表達量高于陰性對照組（P<0.05），而C/EBPα表達量高于陰性對照組（P<0.01）。綜上表明，抑制miR-18b-3p 表達后，SCD、PPARγ及C/EBPα的表達量顯著提高。

2.6 miR-18b-3p 對脂滴生成的影響 分別轉染miR-18b-3p 過表達、抑制及陰性對照載體后，將細胞誘導分化至第8 天，觀察miR-18b-3p 對脂滴生成的影響。如圖9 所示，相較于miR-18b-3p NC 組，過表達miR-18b-3p 后，油紅O 染色面積極顯著減少，抑制 miR-18b-3p 后，油紅O 染色面積顯著增多。由此說明，miR-18b-3p 可以顯著抑制脂滴的生成，即miR-18b-3p負向調控前體脂肪細胞的分化。

圖7 轉染抑制載體后miR-18b-3p 與SCD 基因的表達量

圖8 轉染抑制載體后分化標志基因mRNA 的相對表達量

圖9 miR-18b-3p 對脂滴生成的影響

2.7 miR-18b-3p 與SCD基因的靶向關系驗證 為驗證miR-18b-3p 與SCD基因是否具有直接靶向關系，本研究通過雙熒光素酶進行測定。如圖10 所示，與mimics NC +SCD-3′UTR-wt 相 比，miR-18b-3p mimics+SCD-3’UTR-wt 的表達量降低（P<0.001），由此說明，miR-18b-3p 與SCD基因發(fā)生了結合，抑制了SCD基因表達，從而使熒光素酶活性降低；與mimics NC +SCD-3′UTR-mut 相 比，miR-18b-3p mimics+SCD-3′UTR-mut的表達量無變化，說明在SCD-3′UTR 發(fā)生突變后miR-18b-3p 無法與SCD相結合，對SCD基因的表達無調控作用。綜上說明，miR-18b-3p 與SCD基因具有直接靶向關系。

圖10 miR-18b-3p 與SCD 基因的雙熒光素檢測

3 討 論

肌內脂肪含量是肉品質的關鍵決定因素，前體脂肪細胞的分化機制是當前的研究熱點[1]。目前有關家畜前體脂肪細胞的分化研究大多使用皮下或尾部脂肪組織進行原代分離[11]，如崔京京等[12]使用膠原酶I 消化綿羊腹股溝脂肪組織，消化1 h 后，繼續(xù)培養(yǎng)6 h 細胞出現(xiàn)貼壁。本研究中使用膠原酶II 消化綿羊背最長肌組織，消化時間約為1.5 h，在培養(yǎng)12 h 后細胞開始貼壁。培養(yǎng)條件的差異說明不同部位前體脂肪細胞的形成有所差異，因此本研究采集綿羊背最長肌組織進行肌內前體脂肪細胞的培養(yǎng)更有代表性。本實驗中，細胞誘導分化至8 d 時顯微鏡視野下可見大面積的脂滴，細胞數(shù)量顯著變少，經油紅O 染色后，脂滴被染為紅色，表明細胞分化成功。

PPARγ和C/EBPα相互合作，在脂肪細胞分化和脂肪酸氧化過程中發(fā)揮重要的調控作用，缺失PPARγ基因的小鼠胚胎成纖維細胞在體外模型中無法分化為脂肪細胞[13]，因此在本實驗選擇PPARγ和C/EBPα作為脂肪分化的標志基因。本研究中，PPARγ基因在整個過程中持續(xù)高表達，在4 d 時達到最高，且在0～4 d 的表達量顯著高于C/EBPα，這與大多數(shù)研究結果相一致[14]。PPARγ處于脂肪細胞分化調控網絡的中心位置，尤其在細胞分化早期發(fā)揮著重要作用[14]。C/EBPα基因在0～6 d 呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，6～8 d 時表達量較高，C/EBPα的表達能夠誘導其他成脂基因的表達，從而促進前體脂肪細胞的分化。

近些年來，關于miRNA 在脂肪分化中的作用研究越來越深入，如miR-204、miR-103 及miR-21 可以促進脂肪沉積，miR-130a、miR-155 及 miR-27a 等抑制脂肪沉積[15]。本實驗發(fā)現(xiàn)，miR-18b-3p 在細胞分化過程中表達量先上升后下降，0 d 時表達量低于8 d 時成熟脂肪細胞的表達量，但miR-18b-3p 在雞中0 d 時表達量高于10 d 細胞成熟時的表達量[9]，這可能與基因的物種差異性有關，但推斷miR-18b-3p 可能對前體脂肪細胞分化具有一定的調控作用。在家畜體內，SCD基因在豬、牛、綿羊中具有較好的保守性，主要催化不飽和脂肪酸的生成[10]。研究表明SCD基因在肥尾羊的尾部脂肪沉積中具有重要調控作用[16]。張海波等[19]研究發(fā)現(xiàn)，SCD基因可能促進牦牛IMF 的沉積。丁芳[20]研究發(fā)現(xiàn)，SCD基因在鴨前體脂肪分化中緩慢上調，在分化后期達到最大值。本實驗中，SCD基因表達量持續(xù)上調至6 d，8 d 時表達量下降但與6 d 差異不顯著，由此推斷SCD基因在綿羊前體脂肪細胞分化過程中可能具有促進作用。除此之外，miR-18b-3p、SCD、PPARγ和C/EBPα的表達呈相似的變化趨勢。有研究表明，多種游離脂肪酸都是脂肪分化主調控因子PPARγ的天然配體[21]，因此推斷SCD可能與PPARγ、C/EBPα共同參與同一條調控通路，從而對脂質沉積、代謝產生作用，接下來將對基因所參與的通路進行深入研究。

為了進一步研究miR-18b-3p 對SCD基因的調控作用，本研究分別轉染過表達、抑制、陰性對照載體至前體脂肪細胞，結果表明過表達miR-18b-3p 后，分化標志基因PPARγ和C/EBPα的表達量顯著降低，SCD基因mRNA 及蛋白表達量均降低；抑制miR-18b-3p 后，分化標志基因PPARγ和C/EBPα的表達量顯著升高，靶基因SCDmRNA 及蛋白表達量均升高；通過雙熒光素酶證明了miR-18b-3p 對SCD基因具有直接調控作用。綜上結果表明，miR-18b-3p 可以通過靶向SCD抑制綿羊前體脂肪細胞分化。這是首次在綿羊上證明miR-18b-3p 對前體脂肪細胞分化的調控作用，可為肉羊分子育種提供一定理論參考。

4 結 論

本實驗結果顯示，綿羊前體脂肪細胞生長狀態(tài)良好，細胞誘導分化成功；在細胞分化過程中，miR-18b-3p 的表達量呈先增長后下降趨勢；通過轉染miR-18b-3p 的過表達及抑制載體證明了miR-18b-3p 調控SCD及分化標志基因的表達并抑制綿羊前體脂肪細胞的分化；雙熒光素酶結果表明，miR-18b-3p 可以直接與SCD的3′UTR 相結合。綜上可知，miR-18b-3p 可以通過靶向SCD基因抑制綿羊前體脂肪細胞的分化。